目的:研究肝病人群中隱匿性HBV感染(OBI)患者HBV S基因主要親水區(qū)(MHR)的突變特點(diǎn)及突變病毒株的致瘤性。方法:回顧性分析解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心臨床研究管理中心血清庫(kù)中2011年9月-2016年3月的7 323例患者樣本,分析OBI檢出率及其HBV S基因MHR突變特點(diǎn)。并選取其中一例典型OBI患者來(lái)源的一株新型突變病毒株aa126-127“RPCMNCTI”insertion,用pLVX-Puro慢病毒表達(dá)載體感染HepG2細(xì)胞,通過(guò)嘌呤霉素篩選出突變型的穩(wěn)定細(xì)胞株,同樣方法篩出野生及空載體對(duì)照組穩(wěn)定細(xì)胞株;Western Blot實(shí)驗(yàn)分析目的蛋白表達(dá);通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)分析突變組與野生和空白對(duì)照組細(xì)胞在克隆形成能力和增殖能力上的差異;采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析突變組與野生和空白對(duì)照組細(xì)胞在遷移能力和侵襲能力上的差異;通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和ROS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分析突變組細(xì)胞周期的情況和細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。結(jié)果:樣本庫(kù)中7 323例患者同時(shí)檢測(cè)了血清HBsAg和HBV DNA,篩查出血清HBsAg陰性及HBV DNA陽(yáng)性的OBI患者14例,OBI檢出率為0.191%(14/7323)。14例患者中檢出9種MHR突變類型,除126-127“RPCMNCTI”insertion和F161S變異外其余變異均為已報(bào)道的OBI相關(guān)突變。Western Blot檢測(cè)到突變蛋白表達(dá),鑒定穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功;細(xì)胞腫瘤表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空載體對(duì)照組和野生組細(xì)胞相比,突變組細(xì)胞的增殖、克隆形成和遷移侵襲能力均明顯增加,且突變組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高。結(jié)論:本研究顯示肝病人群中有較高的OBI檢出率,且多數(shù)患者可檢出文獻(xiàn)報(bào)道的OBI相關(guān)突變�！癮a126-127‘RPCMNCTI’insertion”新型突變HBV S基因具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn),可能會(huì)增加慢性HBV感染患者向肝癌進(jìn)展的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
【學(xué)位單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

圖 1 巢式 PCR 擴(kuò)增樣本的 HBV S 基因瓊脂糖電泳結(jié)果Figure.1 Electrophoretic analysis of HBV S gene by nested-PCR ampliM 為電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-14 為患者樣本編號(hào)；+為陽(yáng)性對(duì)照；--為陰

28圖 2 目的片段 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 The aim gene fragment of PCR amplification標(biāo)準(zhǔn)；NG 為 126-127“RPCMNCTI”insertion 突變型；Wt 為 wild

2.2.2 pLVX-Puro-S-his 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果經(jīng) DNA 測(cè)序后比對(duì)，分別成功構(gòu)建野生型 pLVX-Puro-S-his-Wt 和突變型pLVX-Puro-S-his-NG的重組質(zhì)粒，其MHR區(qū)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖3。pLVX-puro 慢病毒質(zhì)粒中插入了 HBV S 基因區(qū)和標(biāo)簽蛋白，使 HBsAg 的 C端加了一個(gè) myc 標(biāo)簽（EQKLISEEDL）和一個(gè) 6 個(gè)組氨酸 H 組成的 His 標(biāo)簽，用于表達(dá) HBsAg-His 標(biāo)簽融合蛋白，因 His 標(biāo)簽不影響 HBsAg 抗原性，其本身也不涉及抗原性，故將 His 標(biāo)簽作為重組蛋白表達(dá)內(nèi)參。圖 3 野生型及突變型重組質(zhì)粒 MHR 氨基酸序列比對(duì)及 S 區(qū)末端融合 myc 和 His 標(biāo)簽Figure 3 Wild-type and mutant recombinant plasmid MHR amino acid sequence alignmentand s-region fusion myc and His tagsS 區(qū)標(biāo)準(zhǔn)序列為來(lái)自 GenBank 上 HBV 野生序列；pLVX-Puro-S-NG 為 aa126-127 “RPCMNCTI”insertion 突變型質(zhì)粒序列；pLVX-Puro-S-Wt 為實(shí)驗(yàn)對(duì)照野生型質(zhì)粒序列；“RPCMNCTI”為突變型基因中間插入序列；“EQKLISEEDL”為 S 基因 C 端 myc 標(biāo)簽序列；“HHHHHH”為 S 基因 C 端 His 標(biāo)簽序列2.3 穩(wěn)定細(xì)胞株重組 HBV S 蛋白的 Western Blotting 分析Western blotting 結(jié)果顯示，野生株產(chǎn)生的 HBsAg-His 標(biāo)簽融合蛋白由 2個(gè)條帶組成，即 1 條 27kD 非糖基化條帶（HBsAg 分子量 24kD

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3 文立民,湯華,張灝,任中原;內(nèi)源性反義RNA在體外抑制乙型肝炎病毒基因表達(dá)的研究[J];天津醫(yī)藥;1995年06期

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本文編號(hào)：2811394