發(fā)布時(shí)間：2020-09-01 07:29

　　 目的通過調(diào)整晝夜明暗交替的時(shí)間,研究晝夜節(jié)律紊亂對C57BL/6小鼠T細(xì)胞功能的影響,同時(shí)應(yīng)用HBV高壓水注射小鼠模型,研究晝夜節(jié)律紊亂對HBV清除的影響。材料和方法1.購買5周齡的雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后,隨機(jī)分為4組,包括晝夜節(jié)律提前組(Advanced circadian rhythm,ACR)、晝夜節(jié)律延遲組(Delayed circadian rhythm,DCR)、晝夜節(jié)律顛倒組(Reversed circadian rhythm,RCR)和正常晝夜節(jié)律組(Normal circadian rhythm,NCR),分別按不同方案進(jìn)行晝夜明暗交替時(shí)間的調(diào)整或維持正常的晝夜明暗交替時(shí)間。2.按上述不同晝夜明暗交替時(shí)間處理2周后,每組處死4只小鼠,分離肝脾淋巴細(xì)胞,并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測相關(guān)免疫細(xì)胞頻率。3.按上述不同晝夜明暗交替時(shí)間處理2周后,通過高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒。在不同時(shí)間點(diǎn)通過小鼠內(nèi)眥靜脈采血,監(jiān)測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb及HBcAb的動(dòng)態(tài)變化。4.通過FlowJo 10軟件分析流式檢測結(jié)果,SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Graphpad prism 7軟件進(jìn)行圖表制作。結(jié)果1.與正常晝夜節(jié)律組小鼠相比,晝夜節(jié)律提前組、晝夜節(jié)律延遲組和晝夜節(jié)律顛倒組C57BL/6小鼠肝脾內(nèi)CD4~+T細(xì)胞、脾內(nèi)CD8~+T細(xì)胞、肝脾內(nèi)CD4~+CD44~+CD62L~-T細(xì)胞頻率降低,肝內(nèi)CD8~+T細(xì)胞頻率升高。2.與正常晝夜節(jié)律組小鼠相比,晝夜節(jié)律提前組、延遲組和顛倒組小鼠肝脾內(nèi)的CD4~+TNF-α~+T細(xì)胞和CD8~+TNF-α~+T細(xì)胞的頻率升高;晝夜節(jié)律提前組和延遲組肝內(nèi)CD8~+IFN-γ~+T細(xì)胞頻率升高;晝夜節(jié)律提前組、延遲組和顛倒組C57BL/6小鼠肝內(nèi)CD4~+Eomes~+T細(xì)胞及CD8~+Eomes~+T細(xì)胞頻率、CD4~+Tbet~+T細(xì)胞及CD8~+Tbet~+T細(xì)胞頻率均增加。3.與正常晝夜節(jié)律組小鼠相比,晝夜節(jié)律提前組小鼠肝內(nèi)CD4~+CD107a~+T細(xì)胞和CD8~+CD107a~+T細(xì)胞頻率增加,而晝夜節(jié)律延遲組和顛倒組肝內(nèi)CD4~+CD107a~+T細(xì)胞和CD8~+CD107a~+T細(xì)胞頻率下降。而脾內(nèi)CD4~+CD107a~+T細(xì)胞和CD8~+CD107a~+T細(xì)胞的頻率在晝夜節(jié)律提前組、延遲組和顛倒組均降低。4.與正常晝夜節(jié)律組小鼠相比,晝夜節(jié)律提前組、延遲組和顛倒組小鼠HBsAg和HBeAg的清除減慢,其HBsAb的產(chǎn)生也相應(yīng)延遲;而HBeAb和HBcAb的水平則不受明顯影響。結(jié)論1.無論是晝夜節(jié)律的提前、延遲和顛倒,均降低了小鼠肝脾內(nèi)的CD4~+T細(xì)胞、脾內(nèi)CD8~+T細(xì)胞和肝脾內(nèi)CD4~+CD44~+CD62L~-T細(xì)胞頻率,雖然其肝內(nèi)表達(dá)TNF-α、INF-γ、Eomes、Tbet等促炎性細(xì)胞因子的T細(xì)胞增多,但肝內(nèi)和脾內(nèi)CD4~+CD107a~+T細(xì)胞和CD8~+CD107a~+T細(xì)胞頻率則下降,提示晝夜節(jié)律的紊亂對小鼠T細(xì)胞的頻率和功能均產(chǎn)生明顯影響。2.無論是晝夜節(jié)律的提前、延遲和顛倒,均延遲了HBV高壓水注射小鼠模型HBV的清除。晝夜節(jié)律紊亂導(dǎo)致T細(xì)胞功能變化可能參與了HBV清除的延遲,但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

圖 1.晝夜節(jié)律紊亂對小鼠 CD4+T 細(xì)胞頻率的影響（A.肝內(nèi) CD4+T 細(xì)胞頻率；B. 脾內(nèi) CD4+T 細(xì)胞頻率）晝夜節(jié)律的提前、延遲和顛倒均增加了小鼠肝內(nèi) CD8+T 細(xì)胞頻率，其中延遲組及顛倒組的細(xì)胞頻率顯著高于正常節(jié)律組（圖 2A）。此外 3 種晝夜節(jié)律紊亂均降低了脾內(nèi) CD8+T 細(xì)胞頻率，但和正常節(jié)律組間的差異無顯著性（圖 2B）。+++

圖 1.晝夜節(jié)律紊亂對小鼠 CD4+T 細(xì)胞頻率的影響（A.肝內(nèi) CD4+T 細(xì)胞頻率；B. 脾內(nèi) CD4+T 細(xì)胞頻率）晝夜節(jié)律的提前、延遲和顛倒均增加了小鼠肝內(nèi) CD8+T 細(xì)胞頻率，其中延遲組及顛倒組的細(xì)胞頻率顯著高于正常節(jié)律組（圖 2A）。此外 3 種晝夜節(jié)律紊亂均降低了脾內(nèi) CD8+T 細(xì)胞頻率，但和正常節(jié)律組間的差異無顯著性（圖 2B）。

圖 3.晝夜節(jié)律紊亂對小鼠 CD4+CD44+CD62L-T 細(xì)胞頻率的影響（A.肝內(nèi) CD4+CD44+CD62L-T 細(xì)胞頻率；B. 脾內(nèi) CD4+CD44+CD62L-T 細(xì)胞頻率）3.1.3 晝夜節(jié)律紊亂對小鼠 T 細(xì)胞促炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響。細(xì)胞因子在炎癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用，可分為促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子，TNF-α、IFN-γ、Eomes、Tbet 等均屬于促炎細(xì)胞因子。TNF-α 是由單核巨噬細(xì)胞和 T 細(xì)胞激活后產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子, 在炎癥反應(yīng)時(shí)起到始動(dòng)和核心作用。本研究中晝夜節(jié)律的提前、延遲和顛倒均增加了小鼠肝內(nèi)CD4+TNF-α+T 細(xì)胞頻率，其中晝夜節(jié)律提前組與正常節(jié)律組相比有顯著差異（圖 4A）。上述 3 種晝夜節(jié)律的調(diào)整還增加了脾內(nèi) CD4+TNF-α+T 細(xì)胞頻率，但和正常節(jié)律組間的差異均無顯著性（圖 4B）。不僅如此，3 種晝夜節(jié)律的調(diào)整還增加了小鼠肝內(nèi)及脾內(nèi)的 CD8+TNF-α+T 細(xì)胞頻率，但均只有晝夜節(jié)律提前組和正常節(jié)律組相比有顯著差異（圖 4C、4D）。

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