第一部分馬拉色菌和人原代角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)液在寬譜中波紫外線影響下對人原代黑素細胞黑素合成的影響目的:建立球形馬拉色菌與人原代角質(zhì)形成細胞即HEKs細胞的共培養(yǎng)模型,并觀察共培養(yǎng)體系在或不在中波紫外線UVB暴露下對人原代黑素細胞即HEMs細胞的增殖、酪氨酸酶活性、酪氨酸蛋白酶在蛋白水平的合成及重要黑素合成通路蛋白的影響。方法:用CCK8方法檢測不同濃度球形馬拉色菌(CBS7966)對HEKs增殖率的影響,并利用實時細胞分析(RTCA)系統(tǒng)監(jiān)測不同濃度馬拉色菌對HEKs增殖曲線的影響,找到馬拉色菌與HEKs細胞共培養(yǎng)最佳比例,建立共培養(yǎng)模型。試驗組分為六組,即HEKs單獨培養(yǎng)組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)組;HEKs單獨培養(yǎng)并接受15mJ/cm2UVB照射組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)并接受15mJ/cm2UVB照射組;HEKs單獨培養(yǎng)并接受75mJ/cm2UVB照射組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)并接受75mJ/cm2UVB照射組。收集上述六組上清,轉(zhuǎn)而培養(yǎng)原代黑素細胞即HEMs細胞,利用實時細胞分析(RTCA)系統(tǒng)監(jiān)測各組培養(yǎng)上清對HEMs細胞的增殖曲線影響,用多巴氧化法檢測各組培養(yǎng)上清對HEMs酪氨酸酶活性的影響;采用transwell小室共培養(yǎng)方法將上述各組細胞與HEMs細胞共培養(yǎng),Western-blot方法檢測HEMs酪氨酸蛋白酶TYR、酪氨酸相關(guān)蛋白酶1(TRP1),及重要相關(guān)通路蛋白MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的合成。結(jié)果:球形馬拉色菌與HEKs以比例1:1共培養(yǎng)時,馬拉色菌不會干擾HEKs細胞增殖活性,但2.5:1及以上組均在一定時間后對HEKs細胞增殖活性產(chǎn)生顯著抑制作用(p0.05)。非紫外線暴露時,各組對HEMs細胞的增殖,酪氨酸酶活性,TYR、TRP1、MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的蛋白合成均無顯著影響(p0.05)。低劑量(15 mJ/cm2)UVB照射后:球形馬拉色菌抑制了 HEKs培養(yǎng)上清對HEMs細胞的促增殖作用(p0.05);HEKs促進了 HEMs細胞TRP1蛋白合成(p0.05),球形馬拉色菌對其促進作用顯著無影響;球形馬拉色菌與HEKs共培養(yǎng)組及HEKs單獨培養(yǎng)組對TYR活性無顯著影響,對TYR、MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的蛋白合成無顯著影響(p0.05);高劑量(75mJ/cm2)UVB照射后:HEKs培養(yǎng)上清抑制了 HEMs增殖活性,而球形馬拉色菌對其抑制作用無顯著影響;球形馬拉色菌抑制了 HEKs培養(yǎng)上清對HEMs細胞酪氨酸酶活性的促進作用,抑制了 HEKs培養(yǎng)上清對黑素合成通路蛋白TYR、TRP1、MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的促合成作用。結(jié)論:寬譜中波紫外線暴露下球形馬拉色菌通過與HEKs相互作用,抑制了HEKs細胞對HEMs細胞的促增殖作用、對酪氨酸酶活性的促進作用、對TYR、TRP1、MITF、p-ERK及p-CREB1合成的促進作用,可能對UVB暴露引起的色素沉著產(chǎn)生一定抑制作用。第二部分馬拉色菌在寬譜中波紫外線影響下對人角質(zhì)形成細胞合成分泌黑素合成相關(guān)細胞因子的影響第一章馬拉色菌在寬譜中波紫外線影響下對原代人表皮角質(zhì)形成細胞(HEKs)合成分泌黑素合成相關(guān)細胞因子的影響目的:觀察球形馬拉色菌對HEKs細胞分泌的一些黑素合成相關(guān)細胞因子的影響。并觀察不同強度UVB照射下馬拉色菌對這些因子產(chǎn)生的影響。方法:試驗組分為六組,即HEKs單獨培養(yǎng)組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)組;HEKs單獨培養(yǎng)并接受15mJ/cm2UVB照射組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)并接受15mJ/cm2UVB照射組;HEKs單獨培養(yǎng)并接受75mJ/cm2UVB照射組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)并接受75mJ/cm2UVB照射組。通過ELISA方法檢測上述六組球形馬拉色菌與HEKs共培養(yǎng)體系及HEKs單獨培養(yǎng)組上清IL-1 α、IL-6、TNF-α、SCF、GM-CSF、b-FGF、EDN1、α-MSH、NT-3、PGE2蛋白表達,用RT-PCR方法檢測細胞裂解液中上述細胞因子的mRNA表達。結(jié)果:在非紫外線暴露時,球形馬拉色菌可刺激HEKs細胞EDN1、PGE2、IL-1α蛋白及mRNA的表達(p0.05),對其他細胞因子無影響(p0.05)。紫外線 UVB 暴露下,HEKs 分泌的 IL-1α、IL-6、TNF-α、SCF、GM-CSF、b-FGF、EDN1、PGE2蛋白表達增加,COX-2、NT-3、POMCmRNA表達增加(NT-3,a-MSH只檢測到了 mRNA)(p0.05)。低劑量(15mJ/cm2)UVB照射條件下,球形馬拉色菌可進一步刺激除TNF-α之外上述細胞因子的表達,對TNF-α表達無影響。而在高劑量(75mJ/cm2)UVB照射條件下,除了進一步刺激IL-1α、IL-6、GM-CSF蛋白及mRNA的表達之外,球形馬拉色菌抑制了 EDN1蛋白及mRNA、TNF-α蛋白及mRNA,COX-2、POMC、NT-3mRNA 的表達(p0.05),對 SCF 及 bFGF 蛋白及mRNA表達無影響(p0.05)。結(jié)論:非UVB暴露或低劑量UVB暴露下,球形馬拉色菌可刺激HEKs分泌促黑素合成細胞因子。在高劑量UVB暴露下,馬拉色菌可抑制HEKs分泌促黑素合成細胞因子,促進HEKs分泌抑制黑素合成的部分細胞因子。第二章馬拉色菌在寬譜中波紫外線影響下對人永生化角質(zhì)形成細胞(hacat細胞)分泌黑素合成相關(guān)細胞因子的影響目的:建立球形馬拉色菌與hacat細胞的共培養(yǎng)模型,觀察球形馬拉色菌對hacat細胞分泌的一些黑素合成相關(guān)細胞因子的影響。并觀察不同強度UVB照射下馬拉色菌對這些因子產(chǎn)生的影響。方法:用CCK8方法檢測不同濃度球形馬拉色菌對hacat細胞增殖率的影響,并利用實時細胞分析(RTCA)系統(tǒng)監(jiān)測不同濃度馬拉色菌對hacat細胞增殖曲線的影響,找到馬拉色菌與HEKs細胞共培養(yǎng)最佳比例,建立共培養(yǎng)模型,并通過ELISA方法檢測不同劑量(0mJ/cm2,15mJ/cm2,75mJ/cm2)寬譜U-VB照射下球形馬拉色菌與hacat細胞共培養(yǎng)體系及hacat單獨培養(yǎng)組上清IL-1α、IL-6、TNF-α、b-FGF、ET-1、SCF、PGE2 蛋白表達。結(jié)果:hacat與馬拉色菌在1:1比例共培養(yǎng)時,在48h內(nèi)會促進hacat細胞增殖(p0.05)。而比例1:1時,在72h內(nèi)對hacat細胞增殖無顯著影響(p0.05)。在一定劑量UVB暴露下,hacat單獨培養(yǎng)組細胞分泌的IL-1α、IL-6、TNF-α、ET-1、PGE2細胞因子蛋白濃度顯著增加(p0.05),而b-FGF和SCF分泌量無明顯變化(p0.05)。在15mJ/cm2UVB照射條件下,球形馬拉色菌促進了 IL-1α蛋白分泌(p0.05),抑制了 IL-6、ET-1、TNF-α 蛋白分泌(p0.05),對 PGE2、b-FGF 和 SCF則無明顯影響(p0.05)。在75mJ/cm2UVB照射條件下,馬拉色菌對IL-6和TNF-α蛋白分泌蛋白分泌量有抑制作用(p0.05),而對其他細胞因子則無顯著影響(p0.05)。結(jié)論:球形馬拉色菌通過與hacat細胞相互作用,在不同紫外線照射條件下,對hacat細胞的黑素合成相關(guān)細胞因子分泌影響不同。在15mJ/cm2UVB暴露下,可抑制ET-1的蛋白分泌,可能抑制了紫外線暴露引起的色素沉著。但需后續(xù)試驗進一步證實。第三部分不同來源的64株馬拉色菌ITS、特異區(qū)基因型特點目的:對64株不同地方來源的馬拉色菌(Pityrosporum)進行ITS,b3和b6測序和演化分析。方法:收集來自南京、四川、上海和江西四個地區(qū)的64株馬拉色菌臨床株,提取DNA,并進行ITS,b3和b6區(qū)PCR擴增及PCR產(chǎn)物純化,測序后進行序列分析,用mega構(gòu)建進化樹。結(jié)果及結(jié)論:通過對Pityrosporum ITS、b3和b6序列的克隆、測序和序列分析,研究發(fā)現(xiàn)來自南京地區(qū)的Pityrosporum的單倍型和核苷酸多樣性都是最高的。Pityrosporum地域性和基因型沒有明顯的相關(guān)性,菌株的基因型和感染的部位也沒有明確的相關(guān)性,但是相同的Pityrosporum在基因型上差異又是比較大的,如南京地區(qū)分離的M.furfur,存在較大的基因多樣性。我們發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的菌株的多樣性高低不同,這可能與受到選擇壓力的影響有關(guān)。系統(tǒng)進化顯示同種的菌株也存在較大的差異。通過用ITS、特異序列b3和b6的研究發(fā)現(xiàn),特異序列b6比ITS和b3更適合于研究Pityrosporum的基因多態(tài)性。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R756
【部分圖文】：

３．１邋ＨＥＫｓ細胞形態(tài)學(xué)逡逑取包皮后三天及一周時倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，細胞貼壁生長，形態(tài)為多逡逑角形。（見圖１－１）逡逑ＩＨ逡逑圖１－１：邋ＨＥＫｓ原代培養(yǎng)鏡下形態(tài)，左圖為第３天形態(tài)，右圖為１周時形態(tài)逡逑（４0ｘ）逡逑３．２原代人表皮黑素細胞細胞形態(tài)學(xué)及免疫熒光染色鑒定逡逑３．２．１原代人表皮黑素細胞培養(yǎng)鏡下形態(tài)學(xué)觀察逡逑黑素細胞培養(yǎng)３天后鏡下可見較多呈卵圓形生長不良的角質(zhì)形成細胞，其周逡逑邊僅有少量具２－４個樹枝狀突起的黑素細胞（圖１左）。黑素細胞開始時生長緩慢，逡逑角質(zhì)形成細胞逐漸減少。２周后，僅見少量角質(zhì)形成細胞殘留，黑素細胞則數(shù)量逡逑明顯增多，樹突及軸絲增長，呈梭形，樹突多為２－３個，中央細胞核折光性較強，逡逑成群網(wǎng)狀排列（圖１右）。逡逑ｍｕ逡逑圖１邋：ＨＥＭｓ原代培養(yǎng)鏡下形態(tài)，左圖為第３天形態(tài)，右圖為２周時形態(tài)（４0ｘ）逡逑３．２．２原代人表皮黑素細胞免疫熒光染色鑒定逡逑經(jīng)過ｍｅｌａｎＡ及Ｓ１００熒光染色后，可見細胞漿和細胞核被染成紅色（９０％逡逑以上細胞）

３．１邋ＨＥＫｓ細胞形態(tài)學(xué)逡逑取包皮后三天及一周時倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，細胞貼壁生長，形態(tài)為多逡逑角形。（見圖１－１）逡逑ＩＨ逡逑圖１－１：邋ＨＥＫｓ原代培養(yǎng)鏡下形態(tài)，左圖為第３天形態(tài)，右圖為１周時形態(tài)逡逑（４0ｘ）逡逑３．２原代人表皮黑素細胞細胞形態(tài)學(xué)及免疫熒光染色鑒定逡逑３．２．１原代人表皮黑素細胞培養(yǎng)鏡下形態(tài)學(xué)觀察逡逑黑素細胞培養(yǎng)３天后鏡下可見較多呈卵圓形生長不良的角質(zhì)形成細胞，其周逡逑邊僅有少量具２－４個樹枝狀突起的黑素細胞（圖１左）。黑素細胞開始時生長緩慢，逡逑角質(zhì)形成細胞逐漸減少。２周后，僅見少量角質(zhì)形成細胞殘留，黑素細胞則數(shù)量逡逑明顯增多，樹突及軸絲增長，呈梭形，樹突多為２－３個，中央細胞核折光性較強，逡逑成群網(wǎng)狀排列（圖１右）。逡逑ｍｕ逡逑圖１邋：ＨＥＭｓ原代培養(yǎng)鏡下形態(tài)，左圖為第３天形態(tài)，右圖為２周時形態(tài)（４0ｘ）逡逑３．２．２原代人表皮黑素細胞免疫熒光染色鑒定逡逑經(jīng)過ｍｅｌａｎＡ及Ｓ１００熒光染色后，可見細胞漿和細胞核被染成紅色（９０％逡逑以上細胞）

圖２：邋ｍｅｌａｎＡ及Ｓ１００焚光染色結(jié)果（上排三個圖為ｍｅｌａｎＡ染色結(jié)果，下逡逑排三個圖為Ｓ１００染色結(jié)果）逡逑３．３不同濃度馬拉色菌對ＨＥＫｓ細胞增殖率的影響（ＣＣＫ－８法）逡逑如圖１－２，共培養(yǎng)２４ｈ后，１：１比例組（ＨＥＫｓ：馬拉色菌）細胞增殖率要高于逡逑對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義（ｐ＞０．０５）。２４ｈ其余比例組、４８ｈ及７２ｈ各比例組細逡逑胞增殖率均小于對照組。７２ｈ內(nèi)１：１及１：１０比例組與對照組相比，馬拉色菌對逡逑ＨＥＫｓ細胞增殖率無影響。在培養(yǎng)４８ｈ、７２ｈ后，１：２０和１：４０比例組與對照組相逡逑比，ＨＥＫｓ增殖率受到顯著抑制（ｐ＜０．０５）。逡逑１５0ｉ逡逑＾邋ＫＣ逡逑５邐ｊ邐■邋１：１逡逑０邋ａｎｎ邐％邐＿邐Ｇ＾３邋１＇邋１０逡逑＾邐Ｉ媝自ｍ曑自＾W自虹ｒ邋ｓ邋１２０逡逑ｒａ１４０逡逑

【參考文獻】

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1 閆瑋;占萍;陳偉;胡素泉;劉維達;;紅色毛癬菌菌落表型和基因型的分型研究[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2014年01期

2 鄧蕙妍;肖峰;高愛莉;李潤祥;朱慧蘭;萬苗堅;;人表皮角質(zhì)形成細胞急性光損傷模型的構(gòu)建[J];新醫(yī)學(xué);2013年08期

3 穰真;崔凡;王有為;李薇;;馬拉色菌屬種內(nèi)基因多態(tài)性機制的分析[J];四川醫(yī)學(xué);2012年10期

4 鄭能能;劉瑋;漆麗婭;陳曉新;;復(fù)發(fā)性念珠菌性陰道炎患者陰道真菌菌群多樣性研究[J];浙江預(yù)防醫(yī)學(xué);2012年02期

5 謝震;冉玉平;劉瑞;楊如學(xué);李志瑜;代亞玲;;從花斑糠疹皮損分離的馬拉色菌隨機擴增多態(tài)性DNA研究[J];中華皮膚科雜志;2009年08期

6 余土根;楊曉紅;朱金土;陶茂燦;劉麗琴;;糠秕馬拉色菌對角質(zhì)形成細胞增殖的作用[J];中華皮膚科雜志;2009年06期

7 占萍;呂雪蓮;佘曉東;符美華;劉維達;;兩足一手型手足癬致病菌種紅色毛癬菌的基因型分析[J];中國皮膚性病學(xué)雜志;2009年01期

8 崔凡;佘曉東;李筱芳;陳先進;沈永年;呂桂霞;劉維達;;馬拉色菌在花斑癬色素改變中的作用[J];中華皮膚科雜志;2008年08期

9 陳菊萍;冉玉平;魏大鵬;代亞玲;周光平;;馬拉色菌與人角質(zhì)形成細胞株共同培養(yǎng)液對培養(yǎng)人黑素細胞生長及酪氨酸酶mRNA表達的影響[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2006年02期

10 崔凡,陶詩沁,沈永年,呂桂霞,陳偉,李筱芳,胡素泉,楊麗佳,劉維達;馬拉色菌臨床株分類鑒定的研究[J];中華皮膚科雜志;2005年08期

本文編號：2808076