瘧疾是一種由按蚊傳播的寄生蟲病,嚴重危害人類健康。WHO最新資料顯示,到2014年全球仍有66萬人死于瘧疾及其引發(fā)的相關疾病,其中90%的瘧疾致死病例發(fā)生在非洲,他們當中大多數(shù)是5歲以下的兒童。瘧疾的流行給疫區(qū)人們的健康和生活造成了毀滅性影響,嚴重阻礙了社會的發(fā)展。惡性瘧是最為兇險的一種瘧疾,富組氨酸蛋白2(Plasmodium falciparum Histidine-rich protein 2,HRP2)是惡性瘧原蟲分泌的一種特有的水溶性生物標志物。WHO建議所有瘧疾疑似患者應該即時進行瘧疾的檢測,疾病的快速、準確診斷對于抗瘧藥的正確使用,避免耐藥株的產(chǎn)生及控制病情惡化、降低死亡率至關重要。目前在Pf HRP2蛋白的空間結構以及單克隆抗體與Pf HRP2蛋白結合的表位識別區(qū)域等方面存在很多研究領域的空白;而且現(xiàn)在使用的檢測該蛋白的試劑靈敏度一般在每微升100個原蟲的檢測范圍,在低密度原蟲感染的情況下有漏檢的風險。為了探究惡性瘧原蟲診斷標志物Pf HRP2蛋白的結構特性,篩選性能優(yōu)異的單克隆抗體,并了解蛋白與抗體之間結合的特性,以及實現(xiàn)更高靈敏度和特異性的檢測方法和性能提升,我們系統(tǒng)性地進行了實驗設計并實施實驗,具體研究內(nèi)容和結果如下:(1)Pf HRP2天然蛋白的提純和重組蛋白的表達。從體外培養(yǎng)的上清及蟲體中提純天然蛋白并通過原核表達系統(tǒng)重組表達Pf HRP2蛋白。為了得到濃度更高的抗原,本研究從紅內(nèi)期收集培養(yǎng)蟲體及上清,用超聲波破碎受感染的紅細胞,充分釋放抗原,繼而利用親和免疫層析方法提純Pf HRP2天然抗原;本實驗同時構建了Pf HRP2原核表達載體,采用含T7噬菌體啟動子的原核高效表達載體p ET-30a(+)進行蛋白表達。實驗結果表明構建的表達載體p ET-30a(+)/HRP2,可表達Pf HRP2可溶蛋白。表達的重組蛋白及天然蛋白經(jīng)快速診斷試劑和免疫印跡實驗驗證,均表明原核表達Pf HRP2蛋白和天然Pf HRP2蛋白與抗體具有良好的共識性。制備的天然抗原及重組蛋白為后面章節(jié)的HRP2抗原免疫,篩選高特異性抗HRP2單克隆抗體,表位鑒定及研制Pf HRP2為標志物的高靈敏度惡性瘧POCT提供基礎。(2)Pf HRP2特異性單克隆抗體的制備及鑒定。本研究在實驗室已有的單抗制備基礎上,優(yōu)化免疫方案及篩選模式,選用基因重組表達的HRP2蛋白和片段化重組HRP2蛋白作為復合免疫原免疫小鼠。片段表達的HRP2蛋白選取親水性和易曲性指數(shù)較高的片段,在篩選環(huán)節(jié)選用重組抗原對融合細胞進行初篩,過濾掉不分泌抗體或分泌抗體低的細胞株,保留陽性值高的細胞株繼續(xù)擴大培養(yǎng);繼而用天然蛋白進行檢測,篩選出能夠與天然結構結合的細胞株,保留分泌抗體效價高,特異性高的陽性細胞株繼續(xù)培養(yǎng)定株。經(jīng)小鼠體內(nèi)誘生法制備腹水,純化得到四株穩(wěn)定分泌抗Pf HRP2的單克隆抗體雜交瘤細胞株3A5、1F6、1C10、5C7。針對抗體進行效價、亞類、特異性、穩(wěn)定性、染色體的鑒定。研究表明,四株細胞分泌的單克隆抗體的亞類1株為Ig M亞類,其余3株均為Ig G1;抗體親和力均大于10-7,表明制備的單克隆抗體與Pf HRP2蛋白的高結合能力;免疫印跡法及RDT的結果顯示四株抗體與Pf HRP2蛋白特異性結合。(3)肽序列掃描及噬菌體肽庫篩選Pf HRP2單克隆抗體抗原結合表位。HRP2是一類基因多態(tài)性的蛋白質(zhì),為了探究該蛋白的表位及研究四株單克隆抗體(3A5,1F6,1C10,5C7)識別位點,本研究用肽序列掃描法及噬菌體隨機十二肽庫篩選方法進行模擬表位分析鑒定。肽序列掃描實驗中,根據(jù)Pf HRP2蛋白序列及預測表位特性設計合成18條多肽,以15個氨基酸為一段多肽,5個氨基酸覆蓋,進行表位鑒定;噬菌體肽庫的篩選選用親和篩選法。實驗結果表明,研制的單克隆抗體的識別位點包括線性表位和構象表位兩類。識別的氨基酸序列有HHAH、AT(S/L)DHH、AAN(S)HH、ADHHH。其中1F6識別的是構象表位,雖然該抗體在多肽序列掃描中無法識別多肽段,但是通過噬菌體的十二肽庫能準確識別其中的位點。位點的確定對于POCT試劑在單克隆抗體的選擇上有了進一步的精確靶標,以確定最佳的結合Pf HRP2氨基酸位點的單克隆抗體的選擇和應用。(4)HRP2免疫熒光快速診斷方法的建立及其應用評估。研究采用熒光納米顆粒標記不同位點Pf HRP2單克隆抗體,通過雙抗體夾心法實現(xiàn)抗原捕獲,采用小型儀器將試劑條上地熒光信號轉(zhuǎn)化成電信號實現(xiàn)檢測,建立了一種全新的快速檢測Pf HRP2抗原POCT熒光檢測免疫層析的方法及試劑。實驗結果表明該方法最低檢出原蟲密度可以達到25個原蟲/μL,較常規(guī)的免疫層析快速診斷試劑的靈敏度有較為明顯的提升。對研制試劑的精密度,穩(wěn)定性,干擾實驗及交叉實驗性能評估結果表明指標都符合要求。在臨床實驗評估中,多中心的平行比對研究表明研制試劑與參比試劑的陽性符合率為100%,陰性符合率為99.6%,總符合率為99.7%。本課題基于Pf HRP2蛋白為研究對象,從蛋白提取表達、單克隆抗體的制備、抗原抗體結合表位分析到免疫熒光檢測系統(tǒng)的建立,進行系統(tǒng)深入的研究和分析。本研究的創(chuàng)新性體現(xiàn)在以下三點:第一,采用新的免疫策略和篩選方法,制備四株具有高親和力、高特異性的Ig M和Ig G不同亞類的抗Pf HRP2蛋白單克隆抗體;第二,使用肽序列掃描法及噬菌體展示技術發(fā)現(xiàn)了Pf HRP2抗原新的模擬表位,Pf HRP2與單克隆抗體與抗體的識別不但存在線性表位也存在構象表位的結合;第三,建立了一種新的高靈敏度Pf HRP2熒光檢測方法及相應試劑,將靈敏度提升到25個原蟲/微升血,超越了現(xiàn)有快速診斷試劑100個原蟲/微升血的檢測水平,為Pf HRP2的標志物檢測靈敏度偏低的現(xiàn)狀提供有效的解決方法。
【學位單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R531.3

【參考文獻】

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1 李妍,寧云山,李莉,彭丹丹,董文其,李明;抗惡性瘧原蟲谷氨酸脫氫酶單克隆抗體的研制與膠體金免疫層析方法的建立[J];第一軍醫(yī)大學學報;2005年04期

2 周光榮;汪峰;耿燕;余希;任蘭香;徐建軍;;貴州省2013年瘧疾疫情流行病學分析[J];中國熱帶醫(yī)學;2015年01期

本文編號：2808449