瘧疾是一種由按蚊傳播的寄生蟲病,嚴(yán)重危害人類健康。WHO最新資料顯示,到2014年全球仍有66萬人死于瘧疾及其引發(fā)的相關(guān)疾病,其中90%的瘧疾致死病例發(fā)生在非洲,他們當(dāng)中大多數(shù)是5歲以下的兒童。瘧疾的流行給疫區(qū)人們的健康和生活造成了毀滅性影響,嚴(yán)重阻礙了社會(huì)的發(fā)展。惡性瘧是最為兇險(xiǎn)的一種瘧疾,富組氨酸蛋白2(Plasmodium falciparum Histidine-rich protein 2,HRP2)是惡性瘧原蟲分泌的一種特有的水溶性生物標(biāo)志物。WHO建議所有瘧疾疑似患者應(yīng)該即時(shí)進(jìn)行瘧疾的檢測(cè),疾病的快速、準(zhǔn)確診斷對(duì)于抗瘧藥的正確使用,避免耐藥株的產(chǎn)生及控制病情惡化、降低死亡率至關(guān)重要。目前在Pf HRP2蛋白的空間結(jié)構(gòu)以及單克隆抗體與Pf HRP2蛋白結(jié)合的表位識(shí)別區(qū)域等方面存在很多研究領(lǐng)域的空白;而且現(xiàn)在使用的檢測(cè)該蛋白的試劑靈敏度一般在每微升100個(gè)原蟲的檢測(cè)范圍,在低密度原蟲感染的情況下有漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。為了探究惡性瘧原蟲診斷標(biāo)志物Pf HRP2蛋白的結(jié)構(gòu)特性,篩選性能優(yōu)異的單克隆抗體,并了解蛋白與抗體之間結(jié)合的特性,以及實(shí)現(xiàn)更高靈敏度和特異性的檢測(cè)方法和性能提升,我們系統(tǒng)性地進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并實(shí)施實(shí)驗(yàn),具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)Pf HRP2天然蛋白的提純和重組蛋白的表達(dá)。從體外培養(yǎng)的上清及蟲體中提純天然蛋白并通過原核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)Pf HRP2蛋白。為了得到濃度更高的抗原,本研究從紅內(nèi)期收集培養(yǎng)蟲體及上清,用超聲波破碎受感染的紅細(xì)胞,充分釋放抗原,繼而利用親和免疫層析方法提純Pf HRP2天然抗原;本實(shí)驗(yàn)同時(shí)構(gòu)建了Pf HRP2原核表達(dá)載體,采用含T7噬菌體啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體p ET-30a(+)進(jìn)行蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明構(gòu)建的表達(dá)載體p ET-30a(+)/HRP2,可表達(dá)Pf HRP2可溶蛋白。表達(dá)的重組蛋白及天然蛋白經(jīng)快速診斷試劑和免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,均表明原核表達(dá)Pf HRP2蛋白和天然Pf HRP2蛋白與抗體具有良好的共識(shí)性。制備的天然抗原及重組蛋白為后面章節(jié)的HRP2抗原免疫,篩選高特異性抗HRP2單克隆抗體,表位鑒定及研制Pf HRP2為標(biāo)志物的高靈敏度惡性瘧POCT提供基礎(chǔ)。(2)Pf HRP2特異性單克隆抗體的制備及鑒定。本研究在實(shí)驗(yàn)室已有的單抗制備基礎(chǔ)上,優(yōu)化免疫方案及篩選模式,選用基因重組表達(dá)的HRP2蛋白和片段化重組HRP2蛋白作為復(fù)合免疫原免疫小鼠。片段表達(dá)的HRP2蛋白選取親水性和易曲性指數(shù)較高的片段,在篩選環(huán)節(jié)選用重組抗原對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行初篩,過濾掉不分泌抗體或分泌抗體低的細(xì)胞株,保留陽性值高的細(xì)胞株繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng);繼而用天然蛋白進(jìn)行檢測(cè),篩選出能夠與天然結(jié)構(gòu)結(jié)合的細(xì)胞株,保留分泌抗體效價(jià)高,特異性高的陽性細(xì)胞株繼續(xù)培養(yǎng)定株。經(jīng)小鼠體內(nèi)誘生法制備腹水,純化得到四株穩(wěn)定分泌抗Pf HRP2的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株3A5、1F6、1C10、5C7。針對(duì)抗體進(jìn)行效價(jià)、亞類、特異性、穩(wěn)定性、染色體的鑒定。研究表明,四株細(xì)胞分泌的單克隆抗體的亞類1株為Ig M亞類,其余3株均為Ig G1;抗體親和力均大于10-7,表明制備的單克隆抗體與Pf HRP2蛋白的高結(jié)合能力;免疫印跡法及RDT的結(jié)果顯示四株抗體與Pf HRP2蛋白特異性結(jié)合。(3)肽序列掃描及噬菌體肽庫篩選Pf HRP2單克隆抗體抗原結(jié)合表位。HRP2是一類基因多態(tài)性的蛋白質(zhì),為了探究該蛋白的表位及研究四株單克隆抗體(3A5,1F6,1C10,5C7)識(shí)別位點(diǎn),本研究用肽序列掃描法及噬菌體隨機(jī)十二肽庫篩選方法進(jìn)行模擬表位分析鑒定。肽序列掃描實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)Pf HRP2蛋白序列及預(yù)測(cè)表位特性設(shè)計(jì)合成18條多肽,以15個(gè)氨基酸為一段多肽,5個(gè)氨基酸覆蓋,進(jìn)行表位鑒定;噬菌體肽庫的篩選選用親和篩選法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,研制的單克隆抗體的識(shí)別位點(diǎn)包括線性表位和構(gòu)象表位兩類。識(shí)別的氨基酸序列有HHAH、AT(S/L)DHH、AAN(S)HH、ADHHH。其中1F6識(shí)別的是構(gòu)象表位,雖然該抗體在多肽序列掃描中無法識(shí)別多肽段,但是通過噬菌體的十二肽庫能準(zhǔn)確識(shí)別其中的位點(diǎn)。位點(diǎn)的確定對(duì)于POCT試劑在單克隆抗體的選擇上有了進(jìn)一步的精確靶標(biāo),以確定最佳的結(jié)合Pf HRP2氨基酸位點(diǎn)的單克隆抗體的選擇和應(yīng)用。(4)HRP2免疫熒光快速診斷方法的建立及其應(yīng)用評(píng)估。研究采用熒光納米顆粒標(biāo)記不同位點(diǎn)Pf HRP2單克隆抗體,通過雙抗體夾心法實(shí)現(xiàn)抗原捕獲,采用小型儀器將試劑條上地?zé)晒庑盘?hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào)實(shí)現(xiàn)檢測(cè),建立了一種全新的快速檢測(cè)Pf HRP2抗原POCT熒光檢測(cè)免疫層析的方法及試劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法最低檢出原蟲密度可以達(dá)到25個(gè)原蟲/μL,較常規(guī)的免疫層析快速診斷試劑的靈敏度有較為明顯的提升。對(duì)研制試劑的精密度,穩(wěn)定性,干擾實(shí)驗(yàn)及交叉實(shí)驗(yàn)性能評(píng)估結(jié)果表明指標(biāo)都符合要求。在臨床實(shí)驗(yàn)評(píng)估中,多中心的平行比對(duì)研究表明研制試劑與參比試劑的陽性符合率為100%,陰性符合率為99.6%,總符合率為99.7%。本課題基于Pf HRP2蛋白為研究對(duì)象,從蛋白提取表達(dá)、單克隆抗體的制備、抗原抗體結(jié)合表位分析到免疫熒光檢測(cè)系統(tǒng)的建立,進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究和分析。本研究的創(chuàng)新性體現(xiàn)在以下三點(diǎn):第一,采用新的免疫策略和篩選方法,制備四株具有高親和力、高特異性的Ig M和Ig G不同亞類的抗Pf HRP2蛋白單克隆抗體;第二,使用肽序列掃描法及噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)了Pf HRP2抗原新的模擬表位,Pf HRP2與單克隆抗體與抗體的識(shí)別不但存在線性表位也存在構(gòu)象表位的結(jié)合;第三,建立了一種新的高靈敏度Pf HRP2熒光檢測(cè)方法及相應(yīng)試劑,將靈敏度提升到25個(gè)原蟲/微升血,超越了現(xiàn)有快速診斷試劑100個(gè)原蟲/微升血的檢測(cè)水平,為Pf HRP2的標(biāo)志物檢測(cè)靈敏度偏低的現(xiàn)狀提供有效的解決方法。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R531.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李妍,寧云山,李莉,彭丹丹,董文其,李明;抗惡性瘧原蟲谷氨酸脫氫酶單克隆抗體的研制與膠體金免疫層析方法的建立[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年04期

2 周光榮;汪峰;耿燕;余希;任蘭香;徐建軍;;貴州省2013年瘧疾疫情流行病學(xué)分析[J];中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué);2015年01期

本文編號(hào)：2808449