【摘要】：目的:以天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2014-2018年149例ICU科室確診真菌血癥患者為研究對象,探索多重PCR和質(zhì)譜技術(shù)兩種方法在酵母樣真菌快速鑒定中的應(yīng)用,分析病原菌分布和抗真菌藥物敏感性特點。調(diào)查ICU真菌血癥患者感染的危險因素,對發(fā)生率最高的近平滑念珠菌導(dǎo)管相關(guān)性血流感染進(jìn)行微衛(wèi)星分型研究,為真菌血癥的早期診斷、治療及院內(nèi)感染的控制提供依據(jù)。內(nèi)容:依據(jù)2008年歐洲腫瘤治療與研究協(xié)作組(EORTC/MSG)制定的《侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)》,研究對象選取2014年1月至2018年12月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院ICU科室血培養(yǎng)分離酵母樣真菌并診斷為真菌血癥患者149例。首先,比較多重PCR和MOLDI-TOF兩種方法在酵母樣真菌快速鑒定中的診斷效率,以通用引物擴增產(chǎn)物測序結(jié)果作為鑒定金標(biāo)準(zhǔn)。第二,了解五年間ICU科室真菌血癥病原菌的分布變遷,以及不同菌種對氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、5-氟胞嘧啶、兩性霉素B的耐藥特點。第三,2014-2018年間酵母樣真菌在血培養(yǎng)分離致病菌中位列第三(占全部致病菌的10.63%),分析ICU真菌血癥感染的臨床特征、危險因素和流行病學(xué)特點。再次,回顧性統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)我院ICU真菌血癥分離率最高的病原菌為近平滑念珠菌,且因生物膜機制多發(fā)生導(dǎo)管相關(guān)性血流感染,因此選取微衛(wèi)星分型方法對12株引起導(dǎo)管相關(guān)性血流感染的近平滑念珠菌進(jìn)行基因分型。方法:(1)對于納入研究的149株酵母樣真菌,臨床常規(guī)應(yīng)用VITEK2 compact進(jìn)行生物編碼鑒定,另選取基于不同原理的快速鑒定方法:基于DNA的分型方法——多重PCR、基于蛋白質(zhì)譜的分型方法——MOLDI-TOF;以通用引物擴增產(chǎn)物測序結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn),比較兩種方法與生物編碼儀器法在真菌鑒定中的準(zhǔn)確性。(2)采用WHONET5.6軟件對149株酵母樣真菌的分布特點和抗真菌藥物敏感性進(jìn)行統(tǒng)計,同時應(yīng)用SPSS 17.0軟件對149例真菌血癥的臨床資料、易感因素進(jìn)行Logistic多因素回歸分析。(3)選取文獻(xiàn)報道的3個分辨率較高的微衛(wèi)星位點CP1、CP4、CP6,分別選用3種熒光素標(biāo)記,進(jìn)行實時定量PCR擴增,產(chǎn)物外送進(jìn)行基因型分析。結(jié)果:(1)對于血培養(yǎng)分離的149株酵母樣菌,VITEK MS鑒定正確率為97.2%且檢測耗時短,明顯優(yōu)于VITEK2 compact。VITEK MS和多重PCR體系對常見五種念珠菌的鑒定正確率為100%;對于不常見酵母樣真菌的快速鑒定,多重PCR方法特異性引物的實驗條件仍需實驗摸索;而VITEK MS在少見念珠菌的鑒定方面更具優(yōu)勢。對于無法鑒定和鑒定錯誤菌株,可采用通用引物PCR方法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。(2)149例真菌血癥以非白念為主要病原菌,念珠菌屬以近平滑念珠菌復(fù)合型分離率最高(64株,43.0%),其次為白色念珠菌(24株,16.1%)、光滑念珠菌(18株,12.1%)、熱帶念珠菌(13株,8.7%),紅酵母屬(12株,8.1%)。隱球菌屬共分離7株,占總數(shù)的4.7%,其中新生隱球菌3株,羅倫特隱球菌4株。149株酵母樣真菌對5-氟胞嘧啶和兩性霉素B的敏感性最高,只出現(xiàn)1株近平滑念珠菌對5-氟胞嘧啶耐藥。白色念珠菌和近平滑念珠菌對唑類藥物的敏感性較高,光滑念珠菌和熱帶念珠菌出現(xiàn)部分耐藥株,其中18株光滑念珠菌對氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑的敏感率分別為72.2%、100%、27.8%,13株熱帶念珠菌對三種唑類藥物的敏感率分別為53.8%、76.9%、30.8%。紅酵母屬對唑類藥物的敏感性較低,隱球菌未出現(xiàn)對唑類藥物耐藥。(3)在ICU血流感染的念珠菌中近平滑念珠菌所占比例最大,原發(fā)感染部位以呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)為主,多部位念珠菌感染的比例達(dá)到34.7%。APACHEⅡ評分、初始治療不充分以及感染源未控制為念珠菌血癥患者死亡的獨立危險因素。(4)通過R語言對三個特異性位點的微衛(wèi)星分型結(jié)果進(jìn)行聚類分析,12株念珠菌可分為5型,使用多種熒光標(biāo)記引物對不同位點同時擴增檢測,可顯著提高分型效能。結(jié)論:(1)2014-2018五年間天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院ICU科室真菌血癥病原菌分離率由高到低依次為近平滑念珠菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌和紅酵母菌,近平滑念珠菌分離率最高應(yīng)引起臨床廣泛重視,可通過后續(xù)對所有致病菌的基因分型研究明確其分子流行病學(xué)特點,積極控制其在院內(nèi)的播散和流行。(2)常見念珠菌中,光滑念珠菌和熱帶念珠菌對唑類藥物的耐藥性明顯高于近平滑念珠菌和白色念珠菌,紅酵母菌對唑類藥物的敏感性較低。(3)MOLDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)在酵母樣真菌的快速鑒定中明顯優(yōu)于生物編碼儀器法;多重PCR技術(shù)無需特殊儀器且成本低廉,更加適用于一般實驗室對常見念珠菌的快速分型。(4)APACHEⅡ評分對ICU真菌血癥的診斷和治療具有重要價值,早期快速診斷真菌感染、優(yōu)化抗真菌治療方案對ICU患者存活率的增加起著關(guān)鍵作用。(5)微衛(wèi)星分型技術(shù)是遺傳多樣性研究的有效工具,分型效率高,適用于臨床微生物實驗室調(diào)查分子流行病特點的相關(guān)研究。少見念珠菌的微衛(wèi)星分型報道較少,針對不同菌種的微衛(wèi)星試驗體系構(gòu)建及方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化有待研究。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R515.3
【圖文】：

2 VITEK2 Compact 與 VITEK MS 鑒定結(jié)果比較[株數(shù)VITEK2 Compact 鑒定到種 鑒定到屬 鑒定錯誤 鑒定到種 鑒定到 56（56/60） 0（0） 4（4/60） 60（60/60） 0（0）0（0） 0（0） 2（2/2） 2（2/2） 0（0）0（0） 0（0） 2（2/2） 0（0） 0（0） 24（24/24） 0（0） 0（0） 24（24/24） 0（0） 18（18/18） 0（0） 0（0） 18（18/18） 0（0）13（13/13） 0（0） 0（0） 13（13/13） 0（0）5（5/5） 0（0） 0（0） 5（5/5） 0（0）2（2/2） 0（0） 0（0） 2（2/2） 0（0）2（2/2） 0（0） 0（0） 2（2/2） 0（0）1（1/1） 0（0） 0（0） 0（0） 0（0）1（1/1） 0（0） 0（0） 0（0） 0（0）0（0） 9（9/9） 0（0） 9（9/9） 0（0）0（0） 3（3/3） 0（0） 3（3/3） 0（0）3（3/3） 0（0） 0（0） 3（3/3） 0（0）4（4/4） 0（0） 0（0） 4（4/4） 0（0） 129（86.6） 12（8.1） 8（5.3） 145（97.3） 0（0）

位點結(jié)果如表 4.3 所示，通過 R 語言進(jìn)行聚類示。表 4.3 微衛(wèi)星分型等位基因位點測定結(jié)果菌株號 CP1 CP4 CP61 243.86 394.76 303.12 243.83 394.8 302.953 240.89 364.39 303.034 243.83 394.81 303.035 243.94 394.76 303.026 243.88 370.65 303.027 243.88 370.50 303.098 243.83 370.45 303.029 243.90 394.71 303.0410 246.07 370.53 303.0711 243.82 394.82 302.9312 243.84 394.82 303.11

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1 葉敏納;張曉兵;;74例真菌血癥流行病學(xué)及預(yù)后因素的回顧性分析[J];中國真菌學(xué)雜志;2017年05期

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本文編號：2797577