【摘要】：目的:克隆和表達結(jié)核分枝桿菌TB10.4,分析TB10.4的免疫學活性,構(gòu)建基于TB10.4的納米金生物傳感器,評價其診斷結(jié)核病的能力,為結(jié)核病的診斷提供新的實驗依據(jù)。方法:根據(jù)GenBank中結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv的TB10.4基因序列設(shè)計引物,采用聚合酶鏈反應(yīng)從H37Rv基因組DNA中擴增目的基因TB10.4,克隆至pMD-18T載體,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109,篩選并鑒定陽性克隆,并予測序分析;將TB10.4基因插入原核表達載體pET-28a(+)中,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coliDH5α,PCR和雙酶切鑒定陽性重組體;將重組子轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21,大量誘導表達TB10.4蛋白,冰浴超聲裂解菌體,His-bindTM柱層析純化TB10.4蛋白。免疫印跡分析TB10.4蛋白的免疫活性,酶聯(lián)免疫吸附測定評價其對于結(jié)核病的診斷價值。采用晶種生長法制備金納米棒,經(jīng)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、十一巰基十一烷酸(MUA)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的化學修飾后,經(jīng)目的蛋白TB10.4修飾,制備納米金生物傳感器,評價其對于結(jié)核病的診斷能力。結(jié)果:PCR擴增和克隆獲得TB10.4基因片段,大小約300 bp,與GenBank中報道的序列一致。將TB10.4基因片段插入原核表達載體,構(gòu)建了 TB10.4蛋白的重組表達質(zhì)粒,金屬螯合層析獲得了分子量約為10.4kDa的TB10.4。免疫印跡證實TB10.4可與結(jié)核患者血清中特異性抗體反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附測定對于結(jié)核患者血清診斷的靈敏度為88.5%,特異度為97.3%,陽性預(yù)測值93.8%,陰性預(yù)測值94.8%,診斷效率達94.5%。種子生長法制備了分散度較好的金納米棒,構(gòu)建了基于TB10.4的納米金生物傳感器,其血清學診斷的靈敏度、特異性和診斷效率分別為96.2%、92.0%、93.3%。結(jié)論:成功構(gòu)建了 TB10.4蛋白的重組表達質(zhì)粒,表達的TB10.4蛋白具有較強的免疫反應(yīng)性,基于TB10.4的納米金生物傳感器可用于診斷結(jié)核病。
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R52
【圖文】：

３結(jié)果逡逑３．邋１目的基因ＴＢ１０．邋４的擴增逡逑ＰＣＲ擴增目的基因的電泳圖譜如圖１。由圖１可知，ＰＣＲ技術(shù)獲得了約為逡逑３００ｂｐ邋的邋ＴＢ１０．４邋基因。逡逑ｖ邋，邐．．邐Ｍ邋Ｍ邋１邋＾邋＾逡逑雇ｆｅ．逡逑兩＇—〗？－逡逑…W逡逑圖１邋ＴＢ１０．４基因的擴增邐圖２ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４的菌落ＰＣＲ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邋；邋１：邋ＴＢ１０．４邋；邐Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒ邋；邋１：陰性對照；逡逑２：陰性對照邐２－６：邋ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４的菌落ＰＣＲ產(chǎn)物逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋ＰＣＲ邋ｏｆ邋ＴＢ邋１０．４邐Ｆｉｇ．２邋ｃｏｌｏｎｙ邋ＰＣＲ邋ｏｆ邋ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４逡逑Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒ邋；邋１：邋ＴＢ１０．４邐Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ；邋１邋：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｒｏｌ逡逑２：Ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邐２－６：邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＴＢ邋１０．４邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｌｏｎｙ逡逑３．２邋ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４陽性克隆的篩選與鑒定逡逑ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４陽性克隆的鑒定圖譜如圖２，由圖２可知，陽性菌落ＰＣＲ逡逑獲得了約為３００ｂｐ的片段。經(jīng)測序分析與目標序列一致。逡逑３．邋３重組質(zhì)粒ＰＥＴ－２８ａ邋（＋）－ＴＢ１０．邋４的酶切鑒定逡逑重組表達質(zhì)粒的雙酶切（Ｂ＿ＨＩ和Ｈｆ／７ｄ邋ＩＩＩ）和菌落ＰＣＲ圖譜如圖３所示，逡逑由圖３可知，雙酶切和菌落ＰＣＲ均獲得約為３００ｂｐ的片段。逡逑２０逡逑

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２：邋Ｔｈｅ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＥＴ－ＴＢ邋１０．４；邋３：邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＴＢ邋１０．４邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｌｏｎｙ逡逑３．邋４目的蛋白的誘導表達及純化逡逑重組表達載體質(zhì)粒經(jīng)ＩＰＴＧ誘導后電泳圖譜如圖４，由圖４可知，誘導前ｐＥＴ－２８ａ（＋）逡逑和ｐＥＴ－ＴＢ邋１０．４質(zhì)粒對ＴＢ邋１０．４都未大量表達，誘導后的ｐＥＴ－ＴＢ邋１０．４質(zhì)粒中ＴＢ邋１０．４逡逑蛋白主要存在于上清中。目的蛋白ＴＢ１０．４的大小約為１０．４ｋＤａ。逡逑純化目的蛋白ＴＢ１０．４的電泳圖譜如圖５。由圖５可知，親和層析獲得純化的目逡逑的蛋白ＴＢ１０．４，大小約１０．４ｋＤａ。逡逑Ｍ邋１邐２邐１邐４邐５邐６逡逑３0邋ｐｍ導；零一邋一P欏義希保哄義賢跡村澹裕洛澹保埃從盞急澩锏牡纈就計族義希停旱鞍字剩恚幔潁耄澹潁誨澹保河盞記爸柿＃穡牛裕玻福幔ǎ誨澹玻河盞己籩柿＃穡牛裕玻福幔ǎ誨澹誨澹常河盞記板義希穡牛裕裕攏歟希矗誨澹矗河盞己螅穡牛裕裕攏保埃慈�；颖K己螅穡牛裕裕攏歟希闖呀夂蟪戀�；ｊ牨K煎義蝦螅穡牛裕裕攏歟希闖呀夂笊锨澹誨義希玻卞義

本文編號：2796698