【摘要】：【研究背景】目前乙型肝炎病毒(HBV)在全球大約有4億慢性感染者,是世界性的健康問題之一。我國是乙型肝炎病毒感染的高發(fā)地區(qū),防治尤為迫切。對于慢性乙型肝炎患者,清除其乙肝表面抗原是目前乙肝治療的理想目標。目前治療慢乙肝常用的抗病毒藥物包括干擾素類(IFN)及核苷(酸)類似物(NA),其中干擾素能夠通過直接抗病毒作用及調(diào)節(jié)機體免疫,實現(xiàn)對乙肝表面抗原(HBsAg)的清除以及血清學轉(zhuǎn)換。本研究也發(fā)現(xiàn),使用干擾素治療的恩替卡韋經(jīng)治患者在治療結(jié)束時的乙肝表面抗原顯著下降,實現(xiàn)乙肝表面抗原消失和達到血清學轉(zhuǎn)換的比率較高,而NK細胞是機體抗病毒免疫中的重要效應細胞之一,在慢性乙肝病毒感染過程中NK細胞的數(shù)量減少及功能低下,而抗病毒治療最終需要達到免疫恢復的狀態(tài),NK細胞的數(shù)量和功能的恢復對于提高抗病毒治療的療效具有重要意義,目前NK細胞作用于乙肝表面抗原的免疫學過程及其機制尚未得到闡明�！狙芯磕康摹垦芯縉K細胞在干擾素治療恩替卡韋經(jīng)治的慢乙肝患者的過程中,清除乙肝表面抗原的作用及其機制,為慢乙肝治療新策略的制定提供理論依據(jù)�！狙芯糠椒ā�1、建立病例對照研究隊列。共入組55名慢性乙型肝炎患者(具體的入組標準和排除標準見“材料與方法”部分),按照1:1的比例將入組患者隨機分為A、B兩組,其中A組使用peginterferon alfa-2a(PEG-IFNα-2a,派羅欣,Roche)180μg/周治療,為防止停用恩替卡韋可能導致的病毒量反彈,先聯(lián)合恩替卡韋治療8周后,再單用PEG-IFNα-2a治療。B組則繼續(xù)恩替卡韋(ETV,博路定,Bristol-Myers Squibb)0.5 mg/天,治療時間共為48周。分別在基線期、4周、12周、24周和48周留取患者的外周血,同時檢測HBVDNA、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb和ALT。病毒學應答(viral responder)的定義:將在治療48周時出現(xiàn)任何乙肝表面抗原下降的患者定義為“responder”。2、利用流式細胞術,在檢測患者臨床指標的同時,檢測兩組患者的外周NK細胞、CD56~(bright)、CD56~(dim)亞群的比例和數(shù)量,同時檢測NK細胞表面活化性受體NKp30、NKp46、NKG2C和NKG2D受體、抑制性受體NKG2A及TRAIL的表達水平。3、通過胞內(nèi)細胞因子(ICK)染色技術檢測治療24周患者NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平。4、通過磁珠分選技術(MACS)分離患者的外周NK細胞,與HepAD38細胞共培養(yǎng),或在培養(yǎng)體系中分別或聯(lián)合加入TRAIL、IFN-r及TNF-a中和抗體,于培養(yǎng)后1天、2天和3天檢測培養(yǎng)上清液中HBsAg的水平,通過Realtime-PCR技術檢測相應的cccDNA(covalently closed circularDNA)水平。5、通過蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)技術檢測,加入TRAIL、IFN-r及TNF-a中和抗體后APOBEC3A及APOBEC3B蛋白的變化�！狙芯拷Y(jié)果】1、與恩替卡韋組相比,干擾素組患者在治療結(jié)束時的乙肝表面抗原顯著下降,實現(xiàn)乙肝表面抗原消失和達到血清學轉(zhuǎn)換的比例較高(P值均小于0.05)。2、兩組總體NK細胞的數(shù)量和比例無明顯變化。亞群分析顯示,與恩替卡韋組相比,干擾素組患者在治療24周和48周時HBsAg顯著下降(P值均小于0.05),在治療24周和48周時干擾素組患者的CD56~(bright)NK細胞顯著增加,而CD56~(dim)NK細胞則顯著減少(P值均小于0.05),干擾素組的“responder”與“non-responder”相比,CD56~brightright NK細胞在12周及24周顯著增加,CD56~(dim)NK細胞則顯著減少(P值均小于0.05)。3、與恩替卡韋組相比,干擾素組患者的NK細胞活化型受體NKp30和NKp46的表達無明顯變化,而CD56~(bright)NK細胞的NKp30和NKp46的表達則自治療4周起至48周均顯著升高(P值均小于0.05),且與干擾素無應答者相比,干擾素應答者NKp30和NKp46的表達在24周時顯著增加(P值均小于0.05)。而在CD56~(dim)NK細胞亞群NKp30和NKp46的表達無顯著變化,活化性受體NKG2D、NKG2C、抑制性受體NKG2A的表達,在恩替卡韋和干擾素兩組間均無顯著差異(P值均大于0.05)。4、與恩替卡韋組相比,干擾素組患者在治療24周時,NK細胞、CD56~(bright)NK細胞及CD56~(dim)NK細胞表達的TRAIL顯著增高,其分泌TNF-a和IFN-r顯著的增加,且CD56~(bright)NK細胞表達的TRAIL增加更為顯著(P值均小于0.05)。5、干擾素治療24周時,患者NK細胞的比例與乙肝表面抗原的下降無顯著相關性(P=0.765,R=0.061),CD56~(bright)NK細胞的比例與乙肝表面抗原下降顯著正相關(P=0.0028,R=0.630),NKp30+CD56~(bright)NK細胞的比例及NKp46+CD56~(bright)NK細胞的比例與乙肝表面抗原的下降無顯著相關性(P值均大于0.05)。6、治療24周時,通過磁性細胞分選技術(MACS)分選獲得干擾素組和恩替卡韋組患者的NK細胞,并與HepG2.2.15 cell共培養(yǎng),結(jié)果顯示共培養(yǎng)1天、2天和3天后干擾素組培養(yǎng)上清中乙肝表面抗原的下降幅度均高于恩替卡韋組(P值均小于0.05)。進一步在培養(yǎng)體系中單獨或聯(lián)合加入TRAIL、IFN-r及TNF-a中和抗體,結(jié)果顯示,與未加中和抗體的對照孔相比,單獨加入TRAIL中和抗體或TRAIL聯(lián)合IFN-r或TNF-a中和抗體的培養(yǎng)上清乙肝表面抗原的水平均顯著增高,cccDNA顯著增加,而APOBEC3A及APOBEC3B蛋白水平下降(P值均大于0.05)。【研究結(jié)論】1、在恩替卡韋經(jīng)治的慢乙肝患者使用干擾素治療24周后,CD56~(bright)NK細胞的數(shù)量和比例逐漸增加,相對應乙肝表面抗原則逐漸下降,且在24周時,乙肝表面抗原的下降和CD56~(bright)NK細胞的增加顯著相關,提示CD56~(bright)NK細胞在乙肝表面抗原清除的過程中可能起到了重要的作用。2、干擾素應答者,其CD56~(bright)NK細胞的活化受體NKp30、NKp46在使用干擾素治療24周升高,提示干擾素治療過程中早期受損的免疫系統(tǒng)功能可能逐漸恢復和重建,而CD56~(bright)NK細胞功能的恢復可能是免疫重建期的重要構(gòu)成之一。3、在干擾素治療24周后,隨著免疫重建的逐漸加強,機體可能逐漸進入了以乙肝表面下降為特點的免疫效應期,其中恢復功能的CD56~(bright)NK細胞可能通過TRAIL/TRAIL-R的溶細胞途徑和IFN-r及TNF-a上調(diào)APOBEC3A和APOBEC3B蛋白,間接非溶細胞途徑清除乙肝表面抗原。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R512.62
【圖文】：

分別在治療的 4 周、12 周、24 周和 48 周時檢測患者外周血的比例，如圖 2-4 所示“responder”與“non-responder”的 NK 細圖 2-4

所示，與“non-responder”相比，A組的“responder”的NKp30+NK細胞和NKp46+NK細胞無顯著變化

30如圖3-4所示，A組的“responder”的NKp30+ CD56brightCD56brightNK 細胞在4周、12周、24周和48周顯著增加(P值

【參考文獻】

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本文編號：2778807