【摘要】：研究背景與目的:乙型病毒性肝炎一直是全球公共健康的重要威脅。為了研究HBV,國內(nèi)外曾使用過多種細(xì)胞模型,如轉(zhuǎn)染了HBV質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞系(Hep G2.215和Hep AD38),這類細(xì)胞缺失了HBV入侵細(xì)胞這一進程;而人原代肝細(xì)胞和Hep RG細(xì)胞雖然能夠在體外感染HBV,但是培養(yǎng)方式復(fù)雜,并且不能無限傳代;肝癌源性細(xì)胞雖然可以無限傳代,但是細(xì)胞表面NTCP的表達量低下,難以感染HBV病毒,以上細(xì)胞均具有一定局限性。2012年11月,李文輝教授宣布發(fā)現(xiàn)了NTCP即為HBV功能性受體,實現(xiàn)了HBV在體外感染肝癌細(xì)胞系,填補了這個空缺�，F(xiàn)有的技術(shù)手段大多把攜帶NTCP基因片段的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞中,NTCP的表達較為短暫,導(dǎo)致HBV感染此種細(xì)胞模型的效率低下且不穩(wěn)定。鑒于此種弊端,本文通過將鈉離子�；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白(NTCP)與GV-358慢病毒載體鏈接,合成了GV358-NTCP重組慢病毒載體,然后將GV358-NTCP轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞,建立出可以在包膜穩(wěn)定表達NTCP蛋白的Huh7細(xì)胞(NTCP-Huh7)。檢測此種細(xì)胞被乙型肝炎病毒(HBV)感染后各種病毒相關(guān)蛋白的表達,以驗證穩(wěn)定表達NTCP的Huh7細(xì)胞是否具有HBV易感性。然后通過將p EFTUD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,使NTCP-Huh7過表達EFTUD2,再次測定上清中病毒相關(guān)蛋白和HBV DNA的表達,以驗證EFTUD2的抑制作用。最后將p EFTUD2和si RIG-1共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,測定細(xì)胞上清HBV DNA含量,確證EFTUD2是否通過RIG-1依賴性途徑發(fā)揮抗病毒作用。方法:1.構(gòu)建GV358-NTCP重組質(zhì)粒,然后用GV358-NTCP感染Huh7細(xì)胞,構(gòu)建出NTCP-Huh7細(xì)胞,此細(xì)胞可以穩(wěn)定表達NTCP基因。2.收集Hep AD38細(xì)胞上清,濃縮提取HBV后以500 qeg/cell的濃度與NTCPHuh7細(xì)胞共孵育,細(xì)胞培養(yǎng)板在1000g/min離心力下離心30分鐘,而后在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18小時,此后換液為肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基,在第2、4、6、8、10、12天收集細(xì)胞上清,然后用免疫熒光、ELISA、q PCR法等技術(shù)檢測病毒蛋白表達以及HBV DNA和HBV ccc DNA的復(fù)制,確定NTCP-Huh7重組細(xì)胞是否具有HBV易感性。3.使用p EFTUD2處理穩(wěn)定表達HBV的NTCP-Huh7細(xì)胞系,觀察不同組別(對照組,EFTUD2過表達組)細(xì)胞上清中的HBV DNA、HBe Ag、HBs Ag的水平,進一步確證EFTUD2抗HBV效應(yīng)。4,將p EFTUD2和si RIG-1共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,比較未處理組、EFTUD2過表達組、RIG-I敲低組、EFTUD2過表達同時RIG-I敲低組細(xì)胞上清中HBV DNA含量,以驗證EFTUD2是否通過RIG-I依賴性途徑發(fā)揮抗病毒作用。結(jié)果:1.PCR鑒定和測序結(jié)果證明重組慢病毒GV358-NTCP構(gòu)建完成,熒光法測得GV358-NTCP重組質(zhì)粒的濃度為2×108TU/ml。使用GV358-NTCP感染Huh7細(xì)胞,經(jīng)過為期一周的藥物篩選,可見表達綠色熒光蛋白的陽性細(xì)胞由之前的10%左后增加到高于90%。Western blot結(jié)果說明NTCP-Huh7細(xì)胞株可表達NTCP。2.使用HBV感染NTCP-Huh7,然后對上清做檢測。ELISA結(jié)果顯示,第4,6,8,10天NTCP-Huh7細(xì)胞上清中HBs Ag以及HBe Ag的含量均高于Huh7組(P0.05),第8天NTCP-Huh7組HBs Ag的OD值(0.866±0.040)和HBe Ag的OD值(0.603±0.053)達到頂峰。取第8天的細(xì)胞進行免疫熒光染色,結(jié)果顯示NTCP-Huh7中可表達HBc Ag。q PCR法顯示:第4,6,8,10,12天NTCP-Huh7組HBV DNA的含量均高于Huh7組(P0.05),第8天NTCP-Huh7組的HBV DNA分泌量(9893.931±741.754 IU/ml)達到高峰。Real-Time PCR法顯示:在感染HBV后的第4,6,8,10,12天,NTCP-Huh7組上清中HBV ccc DNA含量均高于Huh7組,且在第6天HBV ccc DNA表達量達到頂峰。3,將p EFTUD2導(dǎo)入NTCP-Huh7和Hep G2.2.15細(xì)胞系。在Hep G2.2.15中,對照組和EFTUD2過表達組細(xì)胞上清中的HBs Ag含量分別為3.180±0.132、1.779±0.096,HBe Ag含量分別為3.613±0.021、2.101±0.065。當(dāng)p EFTUD2的量為0.5ug、1μg或2μg時,HBV DNA的含量分別為57738.333±1281.097、35607.971±1902.023、30296.495±687.261。在NTCP-Huh7細(xì)胞中,對照組和EFTUD2過表達組細(xì)胞上清中的HBs Ag含量分別為0.782±0.028、0.358±0.022,HBe Ag為0.620±0.024、0.267±0.010。EFTUD2對HBV具有阻斷作用。4,未處理組、EFTUD2過表達組、RIG-I敲低組、EFTUD2過表達同時RIG-I敲低組細(xì)胞上清中HBV DNA含量分別為60983.076±1392.366、30889.608±1341.288、64242.599±1220.242、60469.652±1287.59。對比分析發(fā)現(xiàn)EFTUD2可通過RIG-I依賴性途徑發(fā)揮抗病毒作用。結(jié)論:構(gòu)建GV358-NTCP重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染入Huh7后獲得的NTCP-Huh7細(xì)胞具有HBV易感性。EFTUD2可通過RIG-I依賴性途徑發(fā)揮抗HBV作用。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R512.62
【圖文】：

NTCP基因電泳圖

圖 2 重組載體陽性克隆 PCR 鑒定FIG. 2 Positive clone PCR identification of recombinant carrier.1：空白對照(ddH2O)；2:陰性對照(空載自連對照組)；3：陽性對照(GAPDH)；4：Marker；5挑取的 1~8 號單克隆3.2 使用 GV358-NTCP 慢病毒載體轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞

圖 3 GV358-NTCP 慢病毒載體轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞 4 天后的熒光表達結(jié)果× 100FIG. 3 To observe the fluorescence expression of GV358-NTCP slow virus vector aftertransfection of 293T cells.A：白光視野； B：熒光視野

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 汪媛;徐元宏;;HBV DNA基因分型研究進展[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2013年18期

本文編號：2778109