【摘要】：第一部分 FAH在黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其對代謝重編程的調(diào)控及機(jī)制研究目的:本研究旨在探究黑色素瘤細(xì)胞中FAH的表達(dá)及其對代謝重編程的調(diào)控作用,首先探討FAH是否影響黑素瘤患者及荷瘤小鼠的生存期,進(jìn)一步研究FAH在黑色素瘤細(xì)胞水平所發(fā)揮的作用及其內(nèi)在機(jī)制。在細(xì)胞水平的研究主要集中在FAH對黑色素瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡等生物學(xué)功能的影響及機(jī)制,而其中FAH作用的通路學(xué)研究的重點(diǎn)為FAH對TCA循環(huán)的回補(bǔ)反應(yīng)及對其他代謝途徑如糖代謝、核苷酸及脂肪酸合成代謝等通路的影響。同時(shí)也進(jìn)一步探究促進(jìn)FAH在黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)的因素,其中重點(diǎn)研究CDC5L蛋白的促進(jìn)作用。通過上述研究,有助于更深入的理解黑色素瘤代謝重編程的特征及其中FAH所發(fā)揮的作用,同時(shí)也為FAH成為一種新型的黑色素瘤的治療靶點(diǎn)及預(yù)后指標(biāo)提供理論依據(jù)。方法:(1)采用含有100例人黑色素瘤及良性色素痣的組織芯片,使用免疫組化技術(shù)檢測胞內(nèi)FAH蛋白的含量。從Oncomine數(shù)據(jù)庫中分析兩組包括黑色素瘤、良性色素痣及正常皮膚組織的數(shù)百例人類標(biāo)本中FAH的mRNA表達(dá)量的數(shù)據(jù)集;(2)從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取278例黑色素瘤患者的詳細(xì)信息,Kaplan-Meier生存分析其中腫瘤組織FAH的表達(dá)量與患者總生存率(OS)及無疾病生存率(DFS)的關(guān)系。使用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別構(gòu)建FAH基因穩(wěn)定缺陷及表達(dá)正常的人黑色素瘤細(xì)胞系,并建立荷瘤小鼠模型。比較正常表達(dá)FAH基因的黑色素瘤細(xì)胞與FAH缺陷的黑色素瘤細(xì)胞所構(gòu)建的荷瘤小鼠的生存時(shí)間變化;(3)用siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,研究人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、A875及SK-MEL-1的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡情況;(4)用siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)后,使用mRNA表達(dá)譜芯片研究A375細(xì)胞系的全轉(zhuǎn)錄組mRNA變化,并進(jìn)行GO分析、Pathway分析及Pathway-net的構(gòu)建,分析其中的關(guān)鍵細(xì)胞功能及通路的變化;(5)采用共聚焦顯微鏡、Western blot分析人黑色素瘤細(xì)胞系中的FAH及延胡索酸酶(FH)的表達(dá)及亞細(xì)胞定位;(6)篩選siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)后的A375細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),分析酪氨酸代謝從FAH到TCA循環(huán)的代謝流中的各相關(guān)酶及轉(zhuǎn)運(yùn)子的mRNA表達(dá)變化。用siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,采用試劑盒檢測人黑色素瘤細(xì)胞中的延胡索酸含量,并用Real-time RT-PCR及Western blot驗(yàn)證A375細(xì)胞中酪氨酸代謝從FAH到TCA循環(huán)的代謝流中的各相關(guān)酶及轉(zhuǎn)運(yùn)子的變化;(7)從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取278例黑色素瘤患者的詳細(xì)信息,分析其中腫瘤組織FAH的表達(dá)量與TCA循環(huán)中各個(gè)酶的表達(dá)量的相關(guān)性。篩選siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)后的A375細(xì)胞系的mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),分析TCA循環(huán)中各個(gè)酶的mRNA表達(dá)變化。再用siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,采用Real-time RT-PCR及Western blot驗(yàn)證A375細(xì)胞中TCA循環(huán)中各限速酶的變化,同時(shí)采用~(13)C-D-glucose同位素示蹤技術(shù)分析其中的代謝流方向;(8)篩選siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)后的A375細(xì)胞系的mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),分析檸檬酸來源的脂肪酸合成中各相關(guān)酶的mRNA表達(dá)變化。再用siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,采用Real-time RT-PCR及Western blot驗(yàn)證A375細(xì)胞中檸檬酸來源的脂肪酸合成中各相關(guān)酶的變化;(9)篩選siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)后的A375細(xì)胞系的mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),分析葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子及糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各相關(guān)酶的mRNA表達(dá)變化。再用siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,采用Real-time RT-PCR及Western blot驗(yàn)證A375細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子及糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各限速酶變化,同時(shí)采用~(13)C-D-glucose同位素示蹤技術(shù)分析糖酵解的代謝流方向;(10)用siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,采用葡萄糖檢測試劑盒檢測A375細(xì)胞的葡萄糖消耗率變化;(11)檢索SABiosciences數(shù)據(jù)庫,尋找CDC5L蛋白在FAH基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的結(jié)合位點(diǎn)及序列,構(gòu)建帶HA標(biāo)簽的CDC5L高表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-C-HA-CDC5L-CDS)后轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞,后通過染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)及Real-time PCR驗(yàn)證CDC5L蛋白是否與FAH基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)有效結(jié)合,并進(jìn)一步通過siRNA沉默CDC5L表達(dá)后采用Real-time RT-PCR及Western blot驗(yàn)證FAH的表達(dá)變化。結(jié)果:(1)人黑色素瘤細(xì)胞中的FAH表達(dá)在蛋白及mRNA水平均明顯高于良性色素痣細(xì)胞;(2)臨床黑色素瘤患者的總生存率(OS)及無疾病生存率(DFS)與FAH表達(dá)量呈明顯負(fù)相關(guān),即FAH高表達(dá)的患者生存期明顯縮短。同時(shí)FAH缺陷的人黑色素瘤細(xì)胞接種裸鼠后,荷瘤小鼠的生存時(shí)間較正常組明顯延長;(3)用siRNA抑制FAH表達(dá)后,人黑色素瘤細(xì)胞的增殖減少、凋亡增加并且細(xì)胞周期G1期明顯延長、G2+S期明顯縮短。此外用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,人黑色素瘤細(xì)胞增殖與凋亡未見明顯變化,但細(xì)胞周期G1期稍縮短且G2+S期稍延長;(4)用siRNA沉默A375細(xì)胞中的FAH表達(dá)后,對其進(jìn)行mRNA表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析,其中GO分析顯示小分子代謝、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞遷移、TCA循環(huán)及生物合成等功能學(xué)聚類出現(xiàn)明顯富集。與GO分析一致,Pathway分析顯示代謝通路、細(xì)胞周期、凋亡、HIF-1信號(hào)通路、TCA循環(huán)、酪氨酸及苯丙氨酸代謝等通路學(xué)聚類也出現(xiàn)明顯富集;(5)共聚焦顯微鏡及Western blot分析顯示人黑色素瘤細(xì)胞中FAH主要定位于細(xì)胞質(zhì),而不是線粒體中。而延胡索酸酶(FH)則在線粒體及胞質(zhì)內(nèi)均有分布;(6)用siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)后,人黑色素瘤細(xì)胞中的延胡索酸含量明顯下降;與此一致,用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,人黑色素瘤細(xì)胞中的延胡索酸含量增加。經(jīng)siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)后的A375細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,酪氨酸代謝從FAH到TCA循環(huán)的代謝流中的各相關(guān)酶及轉(zhuǎn)運(yùn)子的mRNA表達(dá)均下降。進(jìn)一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot驗(yàn)證A375細(xì)胞中上述各相關(guān)酶及轉(zhuǎn)運(yùn)子在FAH消減后表達(dá)明顯下降,而在FAH高表達(dá)后表達(dá)稍增加;(7)對來自TCGA數(shù)據(jù)庫的278例黑色素瘤患者的數(shù)據(jù)分析顯示,患者腫瘤組織FAH的表達(dá)量與其TCA循環(huán)中各個(gè)酶的表達(dá)量都呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性。經(jīng)siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)后的A375細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,TCA循環(huán)的各個(gè)酶的mRNA表達(dá)均下降。進(jìn)一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot驗(yàn)證A375細(xì)胞中TCA循環(huán)的各限速酶在FAH消減后表達(dá)明顯下降,而在FAH高表達(dá)后表達(dá)稍增加,同時(shí)用~(13)C-D-glucose同位素示蹤技術(shù)分析顯示FAH消減后TCA循環(huán)的代謝流明顯減速,而在FAH高表達(dá)后代謝流無明顯變化;(8)經(jīng)siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)后的A375細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,檸檬酸來源的脂肪酸合成代謝中的各相關(guān)酶的mRNA表達(dá)均下降。進(jìn)一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot驗(yàn)證A375細(xì)胞中檸檬酸來源的脂肪酸合成中各相關(guān)酶在FAH消減后表達(dá)明顯下降,而在FAH高表達(dá)后表達(dá)稍增加;(9)經(jīng)siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)后的A375細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子、糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各相關(guān)酶的mRNA表達(dá)均下降。進(jìn)一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot驗(yàn)證A375細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子、糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各限速酶在FAH消減后表達(dá)明顯下降,而在FAH高表達(dá)后表達(dá)稍增加;同時(shí)用~(13)C-D-glucose同位素示蹤技術(shù)分析顯示FAH消減后糖酵解代謝流減慢,而在FAH高表達(dá)后代謝流無明顯變化;(10)用siRNA沉默F(xiàn)AH表達(dá)后A375細(xì)胞的葡萄糖消耗率降低,而用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達(dá)FAH后A375細(xì)胞的葡萄糖消耗率無明顯變化;(11)ChIP-qPCR證明CDC5L蛋白可以有效結(jié)合FAH基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的預(yù)測結(jié)合位點(diǎn),并且用siRNA沉默CDC5L表達(dá)后人黑色素瘤細(xì)胞中的FAH的表達(dá)量也明顯下降。結(jié)論:在本研究中,我們的結(jié)果證實(shí)在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中,腫瘤細(xì)胞內(nèi)CDC5L可有效促進(jìn)FAH的高表達(dá),后者可以有效地促進(jìn)TCA循環(huán)中的回補(bǔ)反應(yīng),從而促進(jìn)TCA循環(huán)的代謝流加速。此外,FAH也能促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞對葡萄糖的消耗并加速糖酵解、磷酸戊糖途徑、核苷酸合成及檸檬酸來源的脂肪酸合成等通路的代謝流。而這些代謝通路均是生物合成及能量代謝的重要組成部分,對于維持黑色素瘤細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)、生存與發(fā)展極其重要。與此一致,我們的研究證明FAH的高表達(dá)可明顯影響黑色素瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)功能,如促進(jìn)細(xì)胞增殖及葡萄糖消耗、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展并抑制凋亡等,同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)FAH的表達(dá)與黑色素瘤患者及荷瘤小鼠的生存時(shí)間呈明顯負(fù)相關(guān)。綜上所述,我們推測FAH可能是黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)重要的促瘤因子,并有可能成為黑色素瘤防治中的一個(gè)重要的靶點(diǎn)及獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。然而,對于實(shí)驗(yàn)中所出現(xiàn)的對FAH通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染而進(jìn)一步升高其表達(dá),卻未對黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能產(chǎn)生明顯影響的原因,我們推測可能是與黑色素瘤本身已經(jīng)存在高表達(dá)的FAH與其作用底物有限有關(guān)。FAH在黑色素瘤細(xì)胞中的代謝反應(yīng)可能已趨向飽和,而此時(shí)即使再進(jìn)一步升高FAH的表達(dá),也可能無法有效誘發(fā)細(xì)胞整體水平的功能學(xué)改變,但其中的具體原因我們在后續(xù)研究中還將繼續(xù)探討。本文對FAH的研究也可為闡明黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的深層次代謝學(xué)變化提供新的思路,并可為此類腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。第二部分 缺氧誘導(dǎo)的糖原代謝在尖銳濕疣發(fā)病中的變化及作用研究目的:本研究旨在探討在尖銳濕疣(Condylomata acuminata,CA)發(fā)生發(fā)展的過程中,其疣體內(nèi)的角質(zhì)形成細(xì)胞所發(fā)生的糖代謝學(xué)變化,其中重點(diǎn)關(guān)注糖原代謝所發(fā)揮的作用及調(diào)控機(jī)制,同時(shí)也探討CA疣體中的局部氧濃度變化及對糖原代謝的影響。我們首先收集CA患者的疣體及正常人的包皮組織,然后通過m RNA表達(dá)譜芯片研究兩種組織中的角質(zhì)形成細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)變化,以此預(yù)測在CA發(fā)生發(fā)展過程中疣體內(nèi)的角質(zhì)形成細(xì)胞所發(fā)生的關(guān)鍵基因、功能及通路變化。再通過對上述疣體及正常包皮中的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行PCR、Western blot和免疫組化等分析,來進(jìn)一步驗(yàn)證其中的糖代謝特征,其中重點(diǎn)關(guān)注糖原代謝和糖酵解的變化,同時(shí)也研究TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成等代謝途徑的變化。隨后,通過進(jìn)一步研究CA組織中的糖原水平及糖原合酶GYS1對人角質(zhì)形成細(xì)胞系的影響,來探討CA發(fā)生發(fā)展中角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生的糖原代謝的變化及其影響。同時(shí)也通過多種分子生物學(xué)技術(shù)來探討CA皮損中是否存在局部缺氧改變,以及缺氧是否可影響其中的糖原代謝。通過上述研究,我們希望有利于進(jìn)一步理解CA發(fā)生發(fā)展中的糖代謝學(xué)特征及其影響,也為開發(fā)新型的CA防控策略提供新的思路。方法:(1)經(jīng)同濟(jì)醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意并獲得了患者及志愿者知情同意后,我們收集了46例在同濟(jì)醫(yī)院門診就診的青年男性CA患者的包皮處疣體。并同時(shí)收集了32例青年男性健康志愿者經(jīng)包皮環(huán)切術(shù)取下的正常包皮作為正常對照。然后分別取出疣體及包皮組織中的角質(zhì)形成細(xì)胞后進(jìn)行m RNA表達(dá)譜芯片分析,后續(xù)進(jìn)行了GO分析、Pathway分析、Pathway-net和Signal-net的構(gòu)建等生物信息學(xué)分析來探究其中的關(guān)鍵基因、功能及通路變化;(2)篩選CA及正常包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞的m RNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),分析TCA循環(huán)中各個(gè)酶的m RNA表達(dá)變化,再對數(shù)十例臨床CA患者的疣體組織及正常志愿者的包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行Real-time RT-PCR分析進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果;(3)篩選CA及正常包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞的m RNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),分析葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各相關(guān)酶的m RNA表達(dá)變化,再對數(shù)十例臨床CA患者的疣體組織及正常志愿者的包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行Real-time RT-PCR分析進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果;(4)篩選CA及正常包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞的m RNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),分析糖原代謝各關(guān)鍵酶的m RNA表達(dá)變化,再對數(shù)十例臨床CA患者的疣體組織及正常志愿者的包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行Real-time RT-PCR分析進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果;(5)使用si RNA沉默人角質(zhì)形成細(xì)胞系Ha Ca T細(xì)胞中的GYS1表達(dá)后,分別在常氧(20%O2)及缺氧(1%O2)環(huán)境下培養(yǎng)48h,后通過細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)Ki-67進(jìn)行流式分析細(xì)胞增殖的情況,同時(shí)用凋亡指標(biāo)Annexin/PI染色后流式分析細(xì)胞凋亡的情況;(6)篩選CA及正常包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞的m RNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),分析缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、碳酸酐酶-9(CA-9)等的m RNA表達(dá)變化。再用HIF-1α免疫組化染色CA組織及正常包皮組織,以進(jìn)一步確定其中角質(zhì)形成細(xì)胞的缺氧情況。進(jìn)一步用PAS染色、CA-9免疫組化染色及二者共染色來判斷CA組織及正常包皮組織中角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的糖原含量、缺氧情況及缺氧與糖原表達(dá)的關(guān)系;(7)將Ha Ca T細(xì)胞按不同時(shí)間點(diǎn)分別在常氧(20%O2)及缺氧(1%O2)環(huán)境下培養(yǎng),后通過PAS染色判斷其中的糖原含量。結(jié)果:(1)CA疣體及正常包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞m RNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,GO分析中細(xì)胞周期、小分子代謝、凋亡、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)、葡萄糖代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)、脂類代謝、核苷酸代謝及角質(zhì)形成細(xì)胞增殖等功能學(xué)聚類出現(xiàn)明顯富集。與GO分析一致,Pathway分析顯示代謝通路、細(xì)胞周期、HIF-1信號(hào)通路、嘌呤及嘧啶代謝、糖酵解/糖異生及脂類代謝等通路也出現(xiàn)明顯富集;Singal-net也顯示出在CA疣體角質(zhì)形成細(xì)胞中的HK2、HIF-1Α、LDHA、SLC2A1等代謝基因的表達(dá)較正常組明顯上調(diào),提示這些基因可能是CA發(fā)生發(fā)展過程中起主要調(diào)節(jié)作用的核心代謝基因;(2)CA疣體及正常包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞m RNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示TCA循環(huán)中各個(gè)酶的表達(dá)無明顯變化,臨床CA疣體及正常包皮組織中角質(zhì)形成細(xì)胞的Real-time RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致,TCA循環(huán)中各限速酶的表達(dá)在m RNA水平均無明顯變化;(3)CA疣體及正常包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞m RNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子及糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各限速酶的表達(dá)在疣體中明顯高于正常。臨床CA疣體及正常包皮組織中角質(zhì)形成細(xì)胞的Real-time RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致;(4)CA疣體及正常包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞m RNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示糖原代謝各關(guān)鍵酶的表達(dá)在疣體中明顯高于正常包皮組織,臨床CA疣體及正常包皮組織中角質(zhì)形成細(xì)胞的Real-time RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致;(5)GYS1沉默后的Ha Ca T細(xì)胞在常氧(20%O2)及缺氧(1%O2)培養(yǎng)下均呈現(xiàn)出Ki-67表達(dá)減少,并且凋亡細(xì)胞數(shù)增加;(6)CA疣體及正常包皮組織的角質(zhì)形成細(xì)胞m RNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示疣體中HIF-1α和CA-9的表達(dá)較正常包皮組織明顯升高。HIF-1α免疫組化染色也證明CA疣體組織角質(zhì)形成細(xì)胞的表達(dá)明顯高于正常包皮組織。同時(shí)PAS染色顯示CA疣體組織角質(zhì)形成細(xì)胞中的糖原含量明顯高于正常包皮組織,CA-9免疫組化染色顯示CA疣體組織角質(zhì)形成細(xì)胞的表達(dá)也明顯高于正常包皮組織,并且共染色實(shí)驗(yàn)證明PAS陽性區(qū)與CA-9陽性區(qū)呈現(xiàn)共定位表達(dá);(7)Ha Ca T細(xì)胞在缺氧(1%O2)環(huán)境下培養(yǎng)時(shí),PAS染色陽性率較常氧(20%O2)培養(yǎng)時(shí)均增高,尤其在缺氧培養(yǎng)48h時(shí)陽性率最高。結(jié)論:本研究中,我們發(fā)現(xiàn)CA疣體在發(fā)生發(fā)展的過程中,受病毒感染的角質(zhì)形成細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)局域性缺氧及糖原積累,并且缺氧與糖原積累存在直接關(guān)系。同時(shí)受感染的角質(zhì)形成細(xì)胞的葡萄糖消耗、糖酵解、磷酸戊糖途徑及糖原與核苷酸合成等代謝流均明顯增強(qiáng),而TCA循環(huán)的代謝流卻沒有明顯變化。此現(xiàn)象提示受感染的角質(zhì)形成細(xì)胞攝取的葡萄糖更多的流向了糖酵解的分支——磷酸戊糖途徑,從而增強(qiáng)了核苷酸的合成,同時(shí)也較多的流向了糖原代謝途徑而增多了糖原的合成。這些糖代謝途徑的改變可能與受感染的角質(zhì)形成細(xì)胞出現(xiàn)的局域性缺氧有關(guān),已有多項(xiàng)報(bào)道指出缺氧可誘導(dǎo)GYS1的表達(dá)而有利于糖原積累,而增加的糖原又對維持缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞生存至關(guān)重要。因而,這些代謝學(xué)改變可為闡明CA發(fā)生發(fā)展中局部氧含量及相關(guān)代謝學(xué)的變化,以及糖原積累的作用提供理論依據(jù),并有利于尋找關(guān)鍵的CA代謝學(xué)防治靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.5;R752.53
【圖文】：

48FAH 在人黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá)。A，免疫組化分析人黑色素瘤組織芯達(dá)情況。 B，將上述免疫組化檢測 FAH 表達(dá)的人黑素瘤組織芯片中的度分析，分析采用 IPP6.0 軟件，并選用其中的代表性標(biāo)本。 數(shù)據(jù)表示值; 誤差線代表 SEM; *** 代表 P<0.001（Student's t-檢驗(yàn)）。 C，分ine 數(shù)據(jù)庫中的兩個(gè)不同數(shù)據(jù)集（Haqq 和 Talantov）的黑色素瘤、色素

2. FAH 表達(dá)與黑素瘤患者和荷瘤小鼠的生存期呈負(fù)相關(guān)。A-C, 通過用 shFAH 或慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染及后續(xù)嘌呤霉素篩選，從而構(gòu)建出 FAH 穩(wěn)定消減的 A375 和 A8胞。轉(zhuǎn)染效率通過熒光顯微鏡檢測 GFP 表達(dá)（A）、real-time RT-PCR（B）和 westlot（C）進(jìn)行驗(yàn)證。D，對接種 FAH 穩(wěn)定敲除的或表達(dá)正常的黑色素瘤細(xì)胞所構(gòu)的 BALB/c-裸鼠模型進(jìn)行生存分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM; n = 8; * 代<0.05 ， *** 代表 P<0.001（Student's t-檢驗(yàn)）。 E，使用 SPSS17.0 軟件分析來CGA 數(shù)據(jù)庫的 278 名黑色素瘤患者的總生存率（OS）、無疾病生存率（DFS）及與 FAH 的 mRNA 值的關(guān)系。igure 2. FAH expression is inversely associated with survival in both melanoma patiend melanoma-bearing mice. A-C. Stable FAH knockdown in A375 and A875 cells wchieved by transduction with shFAH or control lentivirus followed by puromycin selectransduction efficiency was verified by GFP detection using fluorescence microscopy (

在黑色素瘤中高表達(dá)的 FAH 與臨床黑色素瘤患者及荷瘤小鼠的生存密切相關(guān)。為了進(jìn)一步研究 FAH 對黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，我們首先了 FAH 對人黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響。我們通過小干擾 RNA（siRNA）及高表粒分別轉(zhuǎn)染人黑色素瘤細(xì)胞系，使細(xì)胞中的 FAH 沉默或高表達(dá)，并且轉(zhuǎn)染效率用 Real-time RT-PCR 和 Western blot 進(jìn)行驗(yàn)證（圖 3A 和 3B）。由于 A875 細(xì)胞無受高表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，因而我們只做了其他兩種人黑色素瘤細(xì)胞系 A375K-MEL-1 的高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。增殖結(jié)果如圖 3C 和 3D 所示，在三種人黑色素胞系中沉默 FAH 的表達(dá)后，其增殖能力均明顯下降，提示 FAH 對人黑色素瘤細(xì)增殖是十分重要的。然而高表達(dá)人黑色素瘤細(xì)胞系中的 FAH 后，其增殖能力卻現(xiàn)明顯改變。我們推測這個(gè)現(xiàn)象可能與人黑色素瘤細(xì)胞本身就已經(jīng)存在明顯高表 FAH 有關(guān)。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi) FAH 的作用底物是有限的，而黑色素瘤細(xì)胞自身高表達(dá)H 的對有限的作用底物的反應(yīng)可能已經(jīng)趨于飽和，此時(shí)即使再進(jìn)一步升高 FAH達(dá)，也可能無法進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞整體水平的明顯增殖改變。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Liem Minh Phan;Sai-Ching Jim Yeung;Mong-Hong Lee;;Cancer metabolic reprogramming: importance, main features, and potentials for precise targeted anti-cancer therapies[J];Cancer Biology & Medicine;2014年01期

本文編號(hào)：2777463