【摘要】：第一部分 FAH在黑色素瘤細胞中的表達及其對代謝重編程的調(diào)控及機制研究目的:本研究旨在探究黑色素瘤細胞中FAH的表達及其對代謝重編程的調(diào)控作用,首先探討FAH是否影響黑素瘤患者及荷瘤小鼠的生存期,進一步研究FAH在黑色素瘤細胞水平所發(fā)揮的作用及其內(nèi)在機制。在細胞水平的研究主要集中在FAH對黑色素瘤細胞增殖、細胞周期及凋亡等生物學功能的影響及機制,而其中FAH作用的通路學研究的重點為FAH對TCA循環(huán)的回補反應及對其他代謝途徑如糖代謝、核苷酸及脂肪酸合成代謝等通路的影響。同時也進一步探究促進FAH在黑色素瘤細胞中表達的因素,其中重點研究CDC5L蛋白的促進作用。通過上述研究,有助于更深入的理解黑色素瘤代謝重編程的特征及其中FAH所發(fā)揮的作用,同時也為FAH成為一種新型的黑色素瘤的治療靶點及預后指標提供理論依據(jù)。方法:(1)采用含有100例人黑色素瘤及良性色素痣的組織芯片,使用免疫組化技術檢測胞內(nèi)FAH蛋白的含量。從Oncomine數(shù)據(jù)庫中分析兩組包括黑色素瘤、良性色素痣及正常皮膚組織的數(shù)百例人類標本中FAH的mRNA表達量的數(shù)據(jù)集;(2)從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取278例黑色素瘤患者的詳細信息,Kaplan-Meier生存分析其中腫瘤組織FAH的表達量與患者總生存率(OS)及無疾病生存率(DFS)的關系。使用慢病毒轉(zhuǎn)染技術分別構建FAH基因穩(wěn)定缺陷及表達正常的人黑色素瘤細胞系,并建立荷瘤小鼠模型。比較正常表達FAH基因的黑色素瘤細胞與FAH缺陷的黑色素瘤細胞所構建的荷瘤小鼠的生存時間變化;(3)用siRNA沉默F(xiàn)AH表達或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,研究人黑色素瘤細胞系A375、A875及SK-MEL-1的細胞增殖、細胞周期及凋亡情況;(4)用siRNA沉默F(xiàn)AH表達后,使用mRNA表達譜芯片研究A375細胞系的全轉(zhuǎn)錄組mRNA變化,并進行GO分析、Pathway分析及Pathway-net的構建,分析其中的關鍵細胞功能及通路的變化;(5)采用共聚焦顯微鏡、Western blot分析人黑色素瘤細胞系中的FAH及延胡索酸酶(FH)的表達及亞細胞定位;(6)篩選siRNA沉默F(xiàn)AH表達后的A375細胞的mRNA表達譜芯片數(shù)據(jù),分析酪氨酸代謝從FAH到TCA循環(huán)的代謝流中的各相關酶及轉(zhuǎn)運子的mRNA表達變化。用siRNA沉默F(xiàn)AH表達或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,采用試劑盒檢測人黑色素瘤細胞中的延胡索酸含量,并用Real-time RT-PCR及Western blot驗證A375細胞中酪氨酸代謝從FAH到TCA循環(huán)的代謝流中的各相關酶及轉(zhuǎn)運子的變化;(7)從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取278例黑色素瘤患者的詳細信息,分析其中腫瘤組織FAH的表達量與TCA循環(huán)中各個酶的表達量的相關性。篩選siRNA沉默F(xiàn)AH表達后的A375細胞系的mRNA表達譜芯片數(shù)據(jù),分析TCA循環(huán)中各個酶的mRNA表達變化。再用siRNA沉默F(xiàn)AH表達或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,采用Real-time RT-PCR及Western blot驗證A375細胞中TCA循環(huán)中各限速酶的變化,同時采用~(13)C-D-glucose同位素示蹤技術分析其中的代謝流方向;(8)篩選siRNA沉默F(xiàn)AH表達后的A375細胞系的mRNA表達譜芯片數(shù)據(jù),分析檸檬酸來源的脂肪酸合成中各相關酶的mRNA表達變化。再用siRNA沉默F(xiàn)AH表達或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,采用Real-time RT-PCR及Western blot驗證A375細胞中檸檬酸來源的脂肪酸合成中各相關酶的變化;(9)篩選siRNA沉默F(xiàn)AH表達后的A375細胞系的mRNA表達譜芯片數(shù)據(jù),分析葡萄糖轉(zhuǎn)運子及糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各相關酶的mRNA表達變化。再用siRNA沉默F(xiàn)AH表達或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,采用Real-time RT-PCR及Western blot驗證A375細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運子及糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各限速酶變化,同時采用~(13)C-D-glucose同位素示蹤技術分析糖酵解的代謝流方向;(10)用siRNA沉默F(xiàn)AH表達或用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,采用葡萄糖檢測試劑盒檢測A375細胞的葡萄糖消耗率變化;(11)檢索SABiosciences數(shù)據(jù)庫,尋找CDC5L蛋白在FAH基因轉(zhuǎn)錄起始點上游的結(jié)合位點及序列,構建帶HA標簽的CDC5L高表達質(zhì)粒(pCMV-C-HA-CDC5L-CDS)后轉(zhuǎn)染A375細胞,后通過染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)及Real-time PCR驗證CDC5L蛋白是否與FAH基因轉(zhuǎn)錄起始點上游的預測結(jié)合位點有效結(jié)合,并進一步通過siRNA沉默CDC5L表達后采用Real-time RT-PCR及Western blot驗證FAH的表達變化。結(jié)果:(1)人黑色素瘤細胞中的FAH表達在蛋白及mRNA水平均明顯高于良性色素痣細胞;(2)臨床黑色素瘤患者的總生存率(OS)及無疾病生存率(DFS)與FAH表達量呈明顯負相關,即FAH高表達的患者生存期明顯縮短。同時FAH缺陷的人黑色素瘤細胞接種裸鼠后,荷瘤小鼠的生存時間較正常組明顯延長;(3)用siRNA抑制FAH表達后,人黑色素瘤細胞的增殖減少、凋亡增加并且細胞周期G1期明顯延長、G2+S期明顯縮短。此外用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,人黑色素瘤細胞增殖與凋亡未見明顯變化,但細胞周期G1期稍縮短且G2+S期稍延長;(4)用siRNA沉默A375細胞中的FAH表達后,對其進行mRNA表達譜芯片實驗并進行后續(xù)的生物信息學分析,其中GO分析顯示小分子代謝、細胞周期阻滯、細胞增殖、凋亡、細胞遷移、TCA循環(huán)及生物合成等功能學聚類出現(xiàn)明顯富集。與GO分析一致,Pathway分析顯示代謝通路、細胞周期、凋亡、HIF-1信號通路、TCA循環(huán)、酪氨酸及苯丙氨酸代謝等通路學聚類也出現(xiàn)明顯富集;(5)共聚焦顯微鏡及Western blot分析顯示人黑色素瘤細胞中FAH主要定位于細胞質(zhì),而不是線粒體中。而延胡索酸酶(FH)則在線粒體及胞質(zhì)內(nèi)均有分布;(6)用siRNA沉默F(xiàn)AH表達后,人黑色素瘤細胞中的延胡索酸含量明顯下降;與此一致,用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,人黑色素瘤細胞中的延胡索酸含量增加。經(jīng)siRNA沉默F(xiàn)AH表達后的A375細胞的mRNA表達譜芯片結(jié)果顯示,酪氨酸代謝從FAH到TCA循環(huán)的代謝流中的各相關酶及轉(zhuǎn)運子的mRNA表達均下降。進一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot驗證A375細胞中上述各相關酶及轉(zhuǎn)運子在FAH消減后表達明顯下降,而在FAH高表達后表達稍增加;(7)對來自TCGA數(shù)據(jù)庫的278例黑色素瘤患者的數(shù)據(jù)分析顯示,患者腫瘤組織FAH的表達量與其TCA循環(huán)中各個酶的表達量都呈現(xiàn)出明顯的正相關性。經(jīng)siRNA沉默F(xiàn)AH表達后的A375細胞的mRNA表達譜芯片結(jié)果顯示,TCA循環(huán)的各個酶的mRNA表達均下降。進一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot驗證A375細胞中TCA循環(huán)的各限速酶在FAH消減后表達明顯下降,而在FAH高表達后表達稍增加,同時用~(13)C-D-glucose同位素示蹤技術分析顯示FAH消減后TCA循環(huán)的代謝流明顯減速,而在FAH高表達后代謝流無明顯變化;(8)經(jīng)siRNA沉默F(xiàn)AH表達后的A375細胞的mRNA表達譜芯片結(jié)果顯示,檸檬酸來源的脂肪酸合成代謝中的各相關酶的mRNA表達均下降。進一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot驗證A375細胞中檸檬酸來源的脂肪酸合成中各相關酶在FAH消減后表達明顯下降,而在FAH高表達后表達稍增加;(9)經(jīng)siRNA沉默F(xiàn)AH表達后的A375細胞的mRNA表達譜芯片結(jié)果顯示,葡萄糖轉(zhuǎn)運子、糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各相關酶的mRNA表達均下降。進一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot驗證A375細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運子、糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各限速酶在FAH消減后表達明顯下降,而在FAH高表達后表達稍增加;同時用~(13)C-D-glucose同位素示蹤技術分析顯示FAH消減后糖酵解代謝流減慢,而在FAH高表達后代謝流無明顯變化;(10)用siRNA沉默F(xiàn)AH表達后A375細胞的葡萄糖消耗率降低,而用FAH-pcDNA3.1質(zhì)粒高表達FAH后A375細胞的葡萄糖消耗率無明顯變化;(11)ChIP-qPCR證明CDC5L蛋白可以有效結(jié)合FAH基因轉(zhuǎn)錄起始點上游的預測結(jié)合位點,并且用siRNA沉默CDC5L表達后人黑色素瘤細胞中的FAH的表達量也明顯下降。結(jié)論:在本研究中,我們的結(jié)果證實在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中,腫瘤細胞內(nèi)CDC5L可有效促進FAH的高表達,后者可以有效地促進TCA循環(huán)中的回補反應,從而促進TCA循環(huán)的代謝流加速。此外,FAH也能促進黑色素瘤細胞對葡萄糖的消耗并加速糖酵解、磷酸戊糖途徑、核苷酸合成及檸檬酸來源的脂肪酸合成等通路的代謝流。而這些代謝通路均是生物合成及能量代謝的重要組成部分,對于維持黑色素瘤細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)、生存與發(fā)展極其重要。與此一致,我們的研究證明FAH的高表達可明顯影響黑色素瘤細胞的多種生物學功能,如促進細胞增殖及葡萄糖消耗、促進細胞周期進展并抑制凋亡等,同時我們還發(fā)現(xiàn)FAH的表達與黑色素瘤患者及荷瘤小鼠的生存時間呈明顯負相關。綜上所述,我們推測FAH可能是黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的一個重要的促瘤因子,并有可能成為黑色素瘤防治中的一個重要的靶點及獨立的預后指標。然而,對于實驗中所出現(xiàn)的對FAH通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染而進一步升高其表達,卻未對黑色素瘤細胞的生物學功能產(chǎn)生明顯影響的原因,我們推測可能是與黑色素瘤本身已經(jīng)存在高表達的FAH與其作用底物有限有關。FAH在黑色素瘤細胞中的代謝反應可能已趨向飽和,而此時即使再進一步升高FAH的表達,也可能無法有效誘發(fā)細胞整體水平的功能學改變,但其中的具體原因我們在后續(xù)研究中還將繼續(xù)探討。本文對FAH的研究也可為闡明黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的深層次代謝學變化提供新的思路,并可為此類腫瘤的治療提供新的靶點。第二部分 缺氧誘導的糖原代謝在尖銳濕疣發(fā)病中的變化及作用研究目的:本研究旨在探討在尖銳濕疣(Condylomata acuminata,CA)發(fā)生發(fā)展的過程中,其疣體內(nèi)的角質(zhì)形成細胞所發(fā)生的糖代謝學變化,其中重點關注糖原代謝所發(fā)揮的作用及調(diào)控機制,同時也探討CA疣體中的局部氧濃度變化及對糖原代謝的影響。我們首先收集CA患者的疣體及正常人的包皮組織,然后通過m RNA表達譜芯片研究兩種組織中的角質(zhì)形成細胞的全轉(zhuǎn)錄組的表達變化,以此預測在CA發(fā)生發(fā)展過程中疣體內(nèi)的角質(zhì)形成細胞所發(fā)生的關鍵基因、功能及通路變化。再通過對上述疣體及正常包皮中的角質(zhì)形成細胞進行PCR、Western blot和免疫組化等分析,來進一步驗證其中的糖代謝特征,其中重點關注糖原代謝和糖酵解的變化,同時也研究TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成等代謝途徑的變化。隨后,通過進一步研究CA組織中的糖原水平及糖原合酶GYS1對人角質(zhì)形成細胞系的影響,來探討CA發(fā)生發(fā)展中角質(zhì)形成細胞發(fā)生的糖原代謝的變化及其影響。同時也通過多種分子生物學技術來探討CA皮損中是否存在局部缺氧改變,以及缺氧是否可影響其中的糖原代謝。通過上述研究,我們希望有利于進一步理解CA發(fā)生發(fā)展中的糖代謝學特征及其影響,也為開發(fā)新型的CA防控策略提供新的思路。方法:(1)經(jīng)同濟醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準同意并獲得了患者及志愿者知情同意后,我們收集了46例在同濟醫(yī)院門診就診的青年男性CA患者的包皮處疣體。并同時收集了32例青年男性健康志愿者經(jīng)包皮環(huán)切術取下的正常包皮作為正常對照。然后分別取出疣體及包皮組織中的角質(zhì)形成細胞后進行m RNA表達譜芯片分析,后續(xù)進行了GO分析、Pathway分析、Pathway-net和Signal-net的構建等生物信息學分析來探究其中的關鍵基因、功能及通路變化;(2)篩選CA及正常包皮組織的角質(zhì)形成細胞的m RNA表達譜芯片數(shù)據(jù),分析TCA循環(huán)中各個酶的m RNA表達變化,再對數(shù)十例臨床CA患者的疣體組織及正常志愿者的包皮組織的角質(zhì)形成細胞進行Real-time RT-PCR分析進一步驗證芯片結(jié)果;(3)篩選CA及正常包皮組織的角質(zhì)形成細胞的m RNA表達譜芯片數(shù)據(jù),分析葡萄糖轉(zhuǎn)運、糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各相關酶的m RNA表達變化,再對數(shù)十例臨床CA患者的疣體組織及正常志愿者的包皮組織的角質(zhì)形成細胞進行Real-time RT-PCR分析進一步驗證芯片結(jié)果;(4)篩選CA及正常包皮組織的角質(zhì)形成細胞的m RNA表達譜芯片數(shù)據(jù),分析糖原代謝各關鍵酶的m RNA表達變化,再對數(shù)十例臨床CA患者的疣體組織及正常志愿者的包皮組織的角質(zhì)形成細胞進行Real-time RT-PCR分析進一步驗證芯片結(jié)果;(5)使用si RNA沉默人角質(zhì)形成細胞系Ha Ca T細胞中的GYS1表達后,分別在常氧(20%O2)及缺氧(1%O2)環(huán)境下培養(yǎng)48h,后通過細胞增殖相關指標Ki-67進行流式分析細胞增殖的情況,同時用凋亡指標Annexin/PI染色后流式分析細胞凋亡的情況;(6)篩選CA及正常包皮組織的角質(zhì)形成細胞的m RNA表達譜芯片數(shù)據(jù),分析缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、碳酸酐酶-9(CA-9)等的m RNA表達變化。再用HIF-1α免疫組化染色CA組織及正常包皮組織,以進一步確定其中角質(zhì)形成細胞的缺氧情況。進一步用PAS染色、CA-9免疫組化染色及二者共染色來判斷CA組織及正常包皮組織中角質(zhì)形成細胞內(nèi)的糖原含量、缺氧情況及缺氧與糖原表達的關系;(7)將Ha Ca T細胞按不同時間點分別在常氧(20%O2)及缺氧(1%O2)環(huán)境下培養(yǎng),后通過PAS染色判斷其中的糖原含量。結(jié)果:(1)CA疣體及正常包皮組織的角質(zhì)形成細胞m RNA表達譜芯片結(jié)果顯示,GO分析中細胞周期、小分子代謝、凋亡、細胞對缺氧的反應、葡萄糖代謝及轉(zhuǎn)運、脂類代謝、核苷酸代謝及角質(zhì)形成細胞增殖等功能學聚類出現(xiàn)明顯富集。與GO分析一致,Pathway分析顯示代謝通路、細胞周期、HIF-1信號通路、嘌呤及嘧啶代謝、糖酵解/糖異生及脂類代謝等通路也出現(xiàn)明顯富集;Singal-net也顯示出在CA疣體角質(zhì)形成細胞中的HK2、HIF-1Α、LDHA、SLC2A1等代謝基因的表達較正常組明顯上調(diào),提示這些基因可能是CA發(fā)生發(fā)展過程中起主要調(diào)節(jié)作用的核心代謝基因;(2)CA疣體及正常包皮組織的角質(zhì)形成細胞m RNA表達譜芯片結(jié)果顯示TCA循環(huán)中各個酶的表達無明顯變化,臨床CA疣體及正常包皮組織中角質(zhì)形成細胞的Real-time RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致,TCA循環(huán)中各限速酶的表達在m RNA水平均無明顯變化;(3)CA疣體及正常包皮組織的角質(zhì)形成細胞m RNA表達譜芯片結(jié)果顯示葡萄糖轉(zhuǎn)運子及糖酵解、磷酸戊糖途徑及核苷酸合成中各限速酶的表達在疣體中明顯高于正常。臨床CA疣體及正常包皮組織中角質(zhì)形成細胞的Real-time RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致;(4)CA疣體及正常包皮組織的角質(zhì)形成細胞m RNA表達譜芯片結(jié)果顯示糖原代謝各關鍵酶的表達在疣體中明顯高于正常包皮組織,臨床CA疣體及正常包皮組織中角質(zhì)形成細胞的Real-time RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致;(5)GYS1沉默后的Ha Ca T細胞在常氧(20%O2)及缺氧(1%O2)培養(yǎng)下均呈現(xiàn)出Ki-67表達減少,并且凋亡細胞數(shù)增加;(6)CA疣體及正常包皮組織的角質(zhì)形成細胞m RNA表達譜芯片結(jié)果顯示疣體中HIF-1α和CA-9的表達較正常包皮組織明顯升高。HIF-1α免疫組化染色也證明CA疣體組織角質(zhì)形成細胞的表達明顯高于正常包皮組織。同時PAS染色顯示CA疣體組織角質(zhì)形成細胞中的糖原含量明顯高于正常包皮組織,CA-9免疫組化染色顯示CA疣體組織角質(zhì)形成細胞的表達也明顯高于正常包皮組織,并且共染色實驗證明PAS陽性區(qū)與CA-9陽性區(qū)呈現(xiàn)共定位表達;(7)Ha Ca T細胞在缺氧(1%O2)環(huán)境下培養(yǎng)時,PAS染色陽性率較常氧(20%O2)培養(yǎng)時均增高,尤其在缺氧培養(yǎng)48h時陽性率最高。結(jié)論:本研究中,我們發(fā)現(xiàn)CA疣體在發(fā)生發(fā)展的過程中,受病毒感染的角質(zhì)形成細胞會出現(xiàn)局域性缺氧及糖原積累,并且缺氧與糖原積累存在直接關系。同時受感染的角質(zhì)形成細胞的葡萄糖消耗、糖酵解、磷酸戊糖途徑及糖原與核苷酸合成等代謝流均明顯增強,而TCA循環(huán)的代謝流卻沒有明顯變化。此現(xiàn)象提示受感染的角質(zhì)形成細胞攝取的葡萄糖更多的流向了糖酵解的分支——磷酸戊糖途徑,從而增強了核苷酸的合成,同時也較多的流向了糖原代謝途徑而增多了糖原的合成。這些糖代謝途徑的改變可能與受感染的角質(zhì)形成細胞出現(xiàn)的局域性缺氧有關,已有多項報道指出缺氧可誘導GYS1的表達而有利于糖原積累,而增加的糖原又對維持缺氧狀態(tài)下的細胞生存至關重要。因而,這些代謝學改變可為闡明CA發(fā)生發(fā)展中局部氧含量及相關代謝學的變化,以及糖原積累的作用提供理論依據(jù),并有利于尋找關鍵的CA代謝學防治靶點。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.5;R752.53
【圖文】：

48FAH 在人黑色素瘤細胞中高表達。A，免疫組化分析人黑色素瘤組織芯達情況。 B，將上述免疫組化檢測 FAH 表達的人黑素瘤組織芯片中的度分析，分析采用 IPP6.0 軟件，并選用其中的代表性標本。 數(shù)據(jù)表示值; 誤差線代表 SEM; *** 代表 P<0.001（Student's t-檢驗）。 C，分ine 數(shù)據(jù)庫中的兩個不同數(shù)據(jù)集（Haqq 和 Talantov）的黑色素瘤、色素

2. FAH 表達與黑素瘤患者和荷瘤小鼠的生存期呈負相關。A-C, 通過用 shFAH 或慢病毒進行轉(zhuǎn)染及后續(xù)嘌呤霉素篩選，從而構建出 FAH 穩(wěn)定消減的 A375 和 A8胞。轉(zhuǎn)染效率通過熒光顯微鏡檢測 GFP 表達（A）、real-time RT-PCR（B）和 westlot（C）進行驗證。D，對接種 FAH 穩(wěn)定敲除的或表達正常的黑色素瘤細胞所構的 BALB/c-裸鼠模型進行生存分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM; n = 8; * 代<0.05 ， *** 代表 P<0.001（Student's t-檢驗）。 E，使用 SPSS17.0 軟件分析來CGA 數(shù)據(jù)庫的 278 名黑色素瘤患者的總生存率（OS）、無疾病生存率（DFS）及與 FAH 的 mRNA 值的關系。igure 2. FAH expression is inversely associated with survival in both melanoma patiend melanoma-bearing mice. A-C. Stable FAH knockdown in A375 and A875 cells wchieved by transduction with shFAH or control lentivirus followed by puromycin selectransduction efficiency was verified by GFP detection using fluorescence microscopy (

在黑色素瘤中高表達的 FAH 與臨床黑色素瘤患者及荷瘤小鼠的生存密切相關。為了進一步研究 FAH 對黑色素瘤細胞生物學功能的影響，我們首先了 FAH 對人黑色素瘤細胞增殖的影響。我們通過小干擾 RNA（siRNA）及高表粒分別轉(zhuǎn)染人黑色素瘤細胞系，使細胞中的 FAH 沉默或高表達，并且轉(zhuǎn)染效率用 Real-time RT-PCR 和 Western blot 進行驗證（圖 3A 和 3B）。由于 A875 細胞無受高表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，因而我們只做了其他兩種人黑色素瘤細胞系 A375K-MEL-1 的高表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗。增殖結(jié)果如圖 3C 和 3D 所示，在三種人黑色素胞系中沉默 FAH 的表達后，其增殖能力均明顯下降，提示 FAH 對人黑色素瘤細增殖是十分重要的。然而高表達人黑色素瘤細胞系中的 FAH 后，其增殖能力卻現(xiàn)明顯改變。我們推測這個現(xiàn)象可能與人黑色素瘤細胞本身就已經(jīng)存在明顯高表 FAH 有關。因為細胞內(nèi) FAH 的作用底物是有限的，而黑色素瘤細胞自身高表達H 的對有限的作用底物的反應可能已經(jīng)趨于飽和，此時即使再進一步升高 FAH達，也可能無法進一步誘發(fā)細胞整體水平的明顯增殖改變。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 Liem Minh Phan;Sai-Ching Jim Yeung;Mong-Hong Lee;;Cancer metabolic reprogramming: importance, main features, and potentials for precise targeted anti-cancer therapies[J];Cancer Biology & Medicine;2014年01期

本文編號：2777463