【摘要】：目的:臨床上經(jīng)核苷(酸)類(lèi)似物(NAs)治療的慢性乙型病毒(hepatitis B virus,HBV)感染患者可發(fā)生HBV RT區(qū)耐藥相關(guān)突變,其中rtA181T突變可同時(shí)引起與RT基因重疊的S基因突變。本研究旨在明確HBV rtA181T突變引起截短型S蛋白的sW172*截短型突變與非截短型S蛋白的sW172L/S非截短型突變的臨床發(fā)生特點(diǎn)及其與NAs耐藥的相關(guān)性。方法:納入2007年-2016年就診解放軍第三0二醫(yī)院臨床研究管理中心的22 009例接受NAs治療的CHB患者,整理患者臨床資料和抗病毒用藥信息,收集血清樣本,應(yīng)用巢式PCR法直接檢測(cè)HBV RT/S區(qū)序列耐藥突變;分析rtA181T突變的臨床發(fā)生特點(diǎn),包括rtA181T引起的s W172*與sW172non-stop突變的臨床發(fā)生特征;此外,對(duì)4例接受過(guò)NAs長(zhǎng)期治療并先后出現(xiàn)rtA181T/sW172*與rtA181T/sW172non-stop突變的rtA181T陽(yáng)性患者樣本進(jìn)行了動(dòng)態(tài)分析,收集患者血清并提取病毒DNA,通過(guò)克隆和測(cè)序分析RT/S區(qū)耐藥突變;篩選出伴有rt A181T/sW172non-stop突變的患者,收集血清樣本,巢式PCR法檢測(cè)其HLA-A2亞型;選取來(lái)源于同一患者的克隆株、構(gòu)建1.1倍HBV重組質(zhì)粒,對(duì)rtA181T/sW172突變相關(guān)的10種不同的突變株及野生株進(jìn)行體外表型耐藥實(shí)驗(yàn)。將野生病毒株與突變株重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞內(nèi),測(cè)定并觀察HBV DNA、HBsAg水平和突變株藥物敏感性。結(jié)果:檢出rtA181T陽(yáng)性突變1182例,發(fā)生比例為5.37%,其中發(fā)生rtA181T突變后反應(yīng)在重疊S區(qū)172位點(diǎn)的變化為截短型(Stop)和非截短型(包含L與S兩種形式)兩種,其中rtA181T/sW172non-stop(sW172L/S),rtA181T/sW172*/non-stop和rtA181T/s W172*的發(fā)生率為7.70%,9.39%和82.91%。rtA181T/sW172non-stop突變患者HBV DNA高于rtA181T/sW172*突變患者,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在1182例發(fā)生rtA181T突變患者中,rtA181T/sW172non-stop突變的發(fā)生率呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)(P0.05):2007-2010年的4.43%(27/610),2011-2013年10.09%(34/337)、2014-2016年的12.77%(30/235)。在聯(lián)合耐藥突變形式上,有44.33%(524/1182)的rtA181T陽(yáng)性突變患者聯(lián)合其他NAs耐藥突變出現(xiàn),其中325例伴有ADV相關(guān)耐藥突變(rtA181V/N236T),57例伴有LAM相關(guān)耐藥突變(rtM204V/I),99例伴有ETV耐藥突變(rtM204V/I±rt184/202/250),43例伴有MDR突變(rtA181V/N236T+rtM204V/I±rt184/202/250)。其中rtA181T/sW172non-stop突變患者中伴隨阿德福韋突變出現(xiàn)頻率高于rtA181T/sW172*突變患者(42.86%/24.59%,P0.001)。rtA181T/sW172non-stop突變患者中HLA-A2陽(yáng)性檢出率為43.07%。表型實(shí)驗(yàn)中,rtA181T/sW172S+N236T、rtA181T/sW172L+N236T相對(duì)于野生株復(fù)制力高于rtA181T/sW172*+N236T的(98.02%、85.45%、42.09%),其相對(duì)于野生株的對(duì)阿德福韋的耐藥倍數(shù)分別是7.38倍、5.49倍、3.69倍。rtA181T/sW172L+S202G+M204V相對(duì)于野生株復(fù)制力高于rtA181T/sW172*+S202G+M204V的(50.98%、34.49%),其相對(duì)于野生株的對(duì)恩替卡韋的耐藥倍數(shù)是524.00倍、69.33倍。結(jié)論:臨床上,近些年在rt A181T陽(yáng)性突變患者中rtA181T/sW172non-stop突變的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢(shì),rtA181T/sW172non-stop突變能夠增加病毒復(fù)制水平,尤其是聯(lián)合阿德福韋酯或恩替卡韋突變株出現(xiàn)時(shí)顯著降低病毒株對(duì)阿德福韋酯或恩替卡韋的敏感性。
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62
【圖文】：

圖 1 PTriEx-1.1-HBV（C）結(jié)構(gòu)示意圖[21]Figure 1 Schematic diagram ofpTriEx-1.1-HBV（C）.2 突變株重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 提取實(shí)驗(yàn)用的目的質(zhì)粒（按照上海生工公司質(zhì)粒提取試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)1） 在 3mL 的液體 LB 培養(yǎng)基中加入 50μL 菌液（pTriEx-1.1-HBV（體和克隆成功的 T-easy 載體菌液），37℃ 220rpm 過(guò)夜。2） 將處理好的菌液轉(zhuǎn)移至 1.5mLEP 管，10000rpm 離心 1 分鐘，移上清。3） 向 EP 管中加入 250μL 的 Buffer P1，經(jīng)渦旋振蕩器處理，使沉混勻，重懸細(xì)菌。4） 向 1.5mL EP 管中加入 250μL 的 Buffer P2，然后馬上溫和顛倒

圖 3 患者中 rtA181T/sW172non-stop 突變的發(fā)生率及 ADV 用藥的構(gòu)成比Figure 3 The prevalence of rtA181T/sW172non-stop mutation and the proportion of ADV exposure in thpatients (*<0.05)4） 我們分析 1182 例 rtA181T 突變患者的 sW172 位點(diǎn)突變及伴隨出現(xiàn)的其 他 耐 藥 突 變 結(jié) 果 顯 示 ， rtA181T/sW172non-stop(sW172L/S) rtA181T/sW172*/non-stop 和 rtA181T/sW172*的發(fā)生率為 7.70% ,9.39%和82.91%。直接測(cè)序中有將近一半的 rtA181T 突變聯(lián)合 ADV 相關(guān)耐藥突變出現(xiàn)，其中 rtA181T/sW172non-stop 中 ADV 相關(guān)耐藥突變的發(fā)生率顯著高于rtA181T/sW172*中的（表 2）

圖 4 HLA-A2 亞型鑒定結(jié)果Figure 4 Identification results of HLA-A2 subtype181T 突變患者演變分析結(jié)果HBV RT/S 區(qū) PCR 擴(kuò)增及 TA 克隆結(jié)果電泳檢測(cè) RT 區(qū)的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，目的產(chǎn)物大小位置在 12期預(yù)測(cè)結(jié)果相符。電泳結(jié)果見(jiàn)下圖，M：DNA 分子量 2000 M上到下的分子量大小為 2000bp，1000bp，750bp，500bp，RT 1M 1 2 3 4

【參考文獻(xiàn)】

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1 王貴強(qiáng);王福生;成軍;任紅;莊輝;孫劍;李蘭娟;李杰;孟慶華;趙景民;段鐘平;侯金林;賈繼東;唐紅;盛吉芳;彭R

本文編號(hào)：2774524