【摘要】：目的:slanDC是特異性的表達(dá)6-磺基N-乙酰乳糖胺(6-sulfo LacNAc,slan)的樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC),是DC的新亞群,具有很強(qiáng)的抗原遞呈功能,在啟動(dòng)T細(xì)胞應(yīng)答、活化NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及誘導(dǎo)ADCC效應(yīng)。HIV-1感染時(shí)slanDC數(shù)目增加,且活化水平增高。半乳糖凝集素-9(Gal-9)是具有嗜酸性粒細(xì)胞趨化活性的β半乳糖苷結(jié)合蛋白,是半乳糖凝集素家族成員之一,在病毒感染、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病中發(fā)揮作用。Tim-3是Gal-9的主要受體,Gal-9/Tim-3信號(hào)通路在調(diào)節(jié)天然免疫反應(yīng)及適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。slanDC是否表達(dá)Gal-9、Tim-3以及HIV-1感染時(shí)slanDC表面Gal-9、Tim-3的變化仍需要進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn),急性HIV-1感染者,慢性HIV-1感染者,接受ARV治療者、精英控制者血漿Gal-9水平高于未感染者,與病毒載量、疾病進(jìn)展、治療與否密切相關(guān)。體外研究發(fā)現(xiàn)Gal-9對(duì)DC成熟功能、分泌細(xì)胞因子及遷移功能有影響。人重組Gal-9可上調(diào)人單核細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞(Monocyte-derived dendritic cells,moDC)表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá),促進(jìn)moDC成熟,上調(diào)IL-12的分泌;人重組Gal-9還可與小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)表面Tim-3作用誘導(dǎo)BMDC成熟,促進(jìn)小鼠心臟移植排斥反應(yīng)。除了促進(jìn)成熟功能外,重組Gal-9可抑制BALB/c小鼠BMDCs成熟、活化及Th2相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子的分泌。slanDC是外周血DC的主要成員,且HIV-1感染時(shí)slanDC數(shù)目增加,已有前期研究表面Gal-9可影響moDC、BMDC的成熟、分泌細(xì)胞因子功能,那么HIV-1感染時(shí)Gal-9是否可通過(guò)影響slanDC表面CD40、CD80、CD83的表達(dá)影響slanDC成熟以及分泌細(xì)胞因子的功能,目前尚未見報(bào)道。除了slanDC外,還可根據(jù)DC表型及功能的不同,將DC分為髓系來(lái)源的樹突狀細(xì)胞(myeloid Dendritic Cells,mDC)和淋巴系來(lái)源的類漿樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid Dendritic Cells,pDC)。已有研究發(fā)現(xiàn),HIV-1感染者mDC、pDC胞內(nèi)存在大量的Gal-9,slanDC表面、胞內(nèi)Gal-9的表達(dá)也有待于進(jìn)一步研究。研究方法:1、研究對(duì)象。本研究選取了HIV-1感染者25例,均接受治療,均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診,經(jīng)免疫印跡試驗(yàn)確認(rèn)為陽(yáng)性。健康對(duì)照組39例,HIV-1抗體陰性,無(wú)免疫系統(tǒng)疾病,未暴露于HIV-1的正常人。納入本課題研究的所有患者均簽署了知情同意書,并通過(guò)了中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員后批準(zhǔn)。2、用密度梯度離心分離法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),并計(jì)數(shù)。取1×10~6細(xì)胞檢測(cè)slanDC、mDC、pDC細(xì)胞表面Gal-9及Tim-3的表達(dá),取1×10~6細(xì)胞用于破膜及破核檢測(cè)slanDC、mDC、pDC胞內(nèi)Gal-9的表達(dá)。取4×10~6細(xì)胞用于檢測(cè)人重組Gal-9對(duì)slanDC表面Tim-3、CD40、CD80及CD83表達(dá)的影響。取6×10~6細(xì)胞用于檢測(cè)人重組Gal-9對(duì)slanDC細(xì)胞因子IL-12分泌的影響。3、檢測(cè)slanDC、mDC、pDC表面Gal-9、Tim-3的表達(dá)。按照BD公司細(xì)胞表面染色說(shuō)明書操作,用LSRⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)slanDC、mDC、pDC表面Gal-9、Tim-3的表達(dá)。5、檢測(cè)slanDC、mDC、pDC胞內(nèi)、核內(nèi)Gal-9的表達(dá)。避光染表面,結(jié)束后,破膜、破核30min,染slanDC、mDC、pDC胞內(nèi)、核內(nèi)分泌的Gal-9,用LSRⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)slanDC、mDC、pDC胞內(nèi)、核內(nèi)Gal-9的表達(dá)。5、人重組Gal-9對(duì)slanDC成熟功能及Tim-3表達(dá)的影響,設(shè)立3組,分別是空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、加重組Gal-9組。每管加入R10培養(yǎng)基500ul,加入LPS 500ug/ml、Gal-9 10ug/ml,混勻后,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后,對(duì)slanDC做表面染色,結(jié)束后應(yīng)用LSRⅡ檢測(cè)slanDC成熟功能及Tim-3表達(dá)的影響。6、人重組Gal-9對(duì)slanDC分泌細(xì)胞因子的影響,取0.5×10~6/管PBMC,分別是空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、加重組Gal-9組。每管加入R10培養(yǎng)基500ul,加入LPS 500ug/ml、Gal-9 10ug/ml,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)slanDC做表面染色,4℃避光染色30min,離心,4℃避光破膜30min,結(jié)束后,加入1ml/管破膜洗液離心,重復(fù)2次。染slanDC胞內(nèi)分泌的IL-12,4℃避光染色30min。結(jié)束后,應(yīng)用LSRⅡ檢測(cè)人重組Gal-9對(duì)slanDC分泌細(xì)胞因子的影響。7、統(tǒng)計(jì)數(shù)學(xué)分析。應(yīng)用Graphpad7.03、SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖形制作,不同組之間t檢驗(yàn),P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、HIV-1感染者、健康對(duì)照組slanDC表面、胞內(nèi)均表達(dá)Gal-9,且胞內(nèi)Gal-9的表達(dá)水平均較表面表達(dá)水平高;HIV-1感染者slanDC表面Gal-9的表達(dá)水平較健康對(duì)照組高;HIV-1感染者slanDC胞內(nèi)Gal-9的表達(dá)水平較健康對(duì)照組低。2、HIV-1感染者、健康對(duì)照組slanDC表面均表達(dá)Tim-3,HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表達(dá)水平較健康對(duì)照組低。重組Gal-9、LPS均使HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表達(dá)水平增加。3、HIV-1感染者slanDC表面CD40、CD80、CD83的表達(dá)水平較健康對(duì)照組slanDC表面CD40、CD80、CD83的表達(dá)水平低。4、HIV-1感染者slanDC分泌細(xì)胞因子IL-12較健康對(duì)照組slanDC分泌的細(xì)胞因子IL-12水平低。5、重組Gal-9使HIV-1感染者slanDC表面CD40、CD80、CD83的表達(dá)水平下降。6、重組Gal-9、LPS使HIV-1感染者slanDC分泌細(xì)胞因子IL-12下降。7、健康對(duì)照組、HIV-1感染者mDC、pDC表面、胞內(nèi)均表達(dá)Gal-9,且胞內(nèi)表達(dá)水平較表面表達(dá)水平高,破膜、破核后Gal-9表達(dá)水平無(wú)明顯變化。8、HIV-1感染者、健康對(duì)照組mDC表面均表達(dá)Tim-3,且HIV-1感染者mDC表面Tim-3的表達(dá)水平較健康對(duì)照組呈下降趨勢(shì);HIV-1感染者、健康對(duì)照組pDC表面均表達(dá)Tim-3,且HIV-1感染者pDC表面Tim-3的表達(dá)水平較健康對(duì)照組下降;HIV-1感染者、健康對(duì)照組mDC表面Tim-3的表達(dá)水平較slanDC、pDC高;HIV-1感染者、健康對(duì)照組slanDC表面Tim-3的表達(dá)水平較pDC高。結(jié)論:HIV-1感染者slanDC表面Gal-9的表達(dá)增加,胞內(nèi)Gal-9的表達(dá)降低。HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表達(dá)降低,重組Gal-9可使HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表達(dá)水平增加。除此之外,重組Gal-9還可使HIV-1感染者slanDC表面CD40、CD80、CD83的表達(dá)水平及slanDC分泌細(xì)胞因子IL-12的水平下降,抑制slanDC的成熟及分泌細(xì)胞因子功能。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R512.91
【圖文】：

加入到 Ficol 液面上，室溫，400g，升速 5/降速 0，離心 30min。從上到下分為 4 層：血漿、PBMC 層（Buffy Coat）、淋巴細(xì)胞及粒細(xì)胞層。將移液管尖端固定在 PBMC 層上方一點(diǎn)，將 PBM個(gè)新的 50ml 離心管中，加 PBS 至 45ml。室溫，300g，升/降速均為離心結(jié)束后，棄上清于高壓滅菌桶中，重懸沉淀細(xì)胞，平均分配至300g，升/降速均為 5，再次離心 5min。取 1×106細(xì)胞檢測(cè) slanD胞表面 Gal-9 及 Tim-3 的表達(dá)，取 4×106細(xì)胞用于破膜及破核檢pDC胞內(nèi)Gal-9的表達(dá)。取0.5×106細(xì)胞用于檢測(cè)外源性Gal-9對(duì)slCD40、CD80 及 CD83 表達(dá)的影響。取 0.5×106細(xì)胞用于檢測(cè)外源分泌細(xì)胞因子 IL-12 的影響。2.3.3 slanDC、mDC、pDC 的圈門策略

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文HLA-DR+的細(xì)胞為 slanDC（p2）分別定義 CD11c+HLA-DR+、CD123+mDC（P3）、pDC（P4）。2.3.4 slanDC、mDC、pDC 表面 Gal-9、Tim-3 的表達(dá)標(biāo)記好流式管，取 1×106/管 PBMC 對(duì) slanDC、mDC、pDC 表達(dá)的做表面染色：HLA-DR-APC-Cy7、M-DC-8-FITC、CD11c-BV421、CGal-9-PE、Tim-3-PE-Cy7，均為 5ul/管�；靹蚝螅�4℃避光染色 30mi入 2mlPBS，室溫，300g，升 5/降 5，離心 5min，離心后棄上清，重懸細(xì)胞及 200ulEDTA 后應(yīng)用 LSRⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)lowJo 進(jìn)行分析略如圖 2 所示：

7圖 3 slanDC、mDC、pDC 胞內(nèi) Gal-9 的測(cè)定 為淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞與單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞之間的細(xì)胞，以 p1 為門，定義 MR+的細(xì)胞為 slanDC（p2），定義 CD11c+HLA-DR+、CD123+HLA-DR+細(xì)胞為pDC（P4）。再以 p2、p3、p4 為門分析 slanDC、mDC、pDC 胞內(nèi)、核內(nèi) Gal-9 的重組 Gal-9 對(duì) slanDCCD40、CD80、CD83 及 Tim-3 表達(dá)的影響記好流式管，取 0.5×106/管 PBMC，分別是空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、-9 組。每管加入 R10 培養(yǎng)基 500ul，加入 LPS 500ug/ml、Gal-9 10ug/ml，破膜對(duì)照 破膜 破核對(duì)照破核

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