發(fā)布時間：2020-07-25 12:13

【摘要】：目的:slanDC是特異性的表達6-磺基N-乙酰乳糖胺(6-sulfo LacNAc,slan)的樹突狀細胞(Dendritic cells,DC),是DC的新亞群,具有很強的抗原遞呈功能,在啟動T細胞應答、活化NK細胞分泌細胞因子及誘導ADCC效應。HIV-1感染時slanDC數目增加,且活化水平增高。半乳糖凝集素-9(Gal-9)是具有嗜酸性粒細胞趨化活性的β半乳糖苷結合蛋白,是半乳糖凝集素家族成員之一,在病毒感染、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病中發(fā)揮作用。Tim-3是Gal-9的主要受體,Gal-9/Tim-3信號通路在調節(jié)天然免疫反應及適應性免疫反應中發(fā)揮重要作用。slanDC是否表達Gal-9、Tim-3以及HIV-1感染時slanDC表面Gal-9、Tim-3的變化仍需要進一步研究。研究發(fā)現(xiàn),急性HIV-1感染者,慢性HIV-1感染者,接受ARV治療者、精英控制者血漿Gal-9水平高于未感染者,與病毒載量、疾病進展、治療與否密切相關。體外研究發(fā)現(xiàn)Gal-9對DC成熟功能、分泌細胞因子及遷移功能有影響。人重組Gal-9可上調人單核細胞源性樹突狀細胞(Monocyte-derived dendritic cells,moDC)表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達,促進moDC成熟,上調IL-12的分泌;人重組Gal-9還可與小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)表面Tim-3作用誘導BMDC成熟,促進小鼠心臟移植排斥反應。除了促進成熟功能外,重組Gal-9可抑制BALB/c小鼠BMDCs成熟、活化及Th2相關的促炎性細胞因子的分泌。slanDC是外周血DC的主要成員,且HIV-1感染時slanDC數目增加,已有前期研究表面Gal-9可影響moDC、BMDC的成熟、分泌細胞因子功能,那么HIV-1感染時Gal-9是否可通過影響slanDC表面CD40、CD80、CD83的表達影響slanDC成熟以及分泌細胞因子的功能,目前尚未見報道。除了slanDC外,還可根據DC表型及功能的不同,將DC分為髓系來源的樹突狀細胞(myeloid Dendritic Cells,mDC)和淋巴系來源的類漿樣樹突狀細胞(plasmacytoid Dendritic Cells,pDC)。已有研究發(fā)現(xiàn),HIV-1感染者mDC、pDC胞內存在大量的Gal-9,slanDC表面、胞內Gal-9的表達也有待于進一步研究。研究方法:1、研究對象。本研究選取了HIV-1感染者25例,均接受治療,均來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診,經免疫印跡試驗確認為陽性。健康對照組39例,HIV-1抗體陰性,無免疫系統(tǒng)疾病,未暴露于HIV-1的正常人。納入本課題研究的所有患者均簽署了知情同意書,并通過了中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員后批準。2、用密度梯度離心分離法提取外周血單個核細胞(PBMC),并計數。取1×10~6細胞檢測slanDC、mDC、pDC細胞表面Gal-9及Tim-3的表達,取1×10~6細胞用于破膜及破核檢測slanDC、mDC、pDC胞內Gal-9的表達。取4×10~6細胞用于檢測人重組Gal-9對slanDC表面Tim-3、CD40、CD80及CD83表達的影響。取6×10~6細胞用于檢測人重組Gal-9對slanDC細胞因子IL-12分泌的影響。3、檢測slanDC、mDC、pDC表面Gal-9、Tim-3的表達。按照BD公司細胞表面染色說明書操作,用LSRⅡ流式細胞儀檢測slanDC、mDC、pDC表面Gal-9、Tim-3的表達。5、檢測slanDC、mDC、pDC胞內、核內Gal-9的表達。避光染表面,結束后,破膜、破核30min,染slanDC、mDC、pDC胞內、核內分泌的Gal-9,用LSRⅡ流式細胞儀檢測slanDC、mDC、pDC胞內、核內Gal-9的表達。5、人重組Gal-9對slanDC成熟功能及Tim-3表達的影響,設立3組,分別是空白對照組、陽性對照組、加重組Gal-9組。每管加入R10培養(yǎng)基500ul,加入LPS 500ug/ml、Gal-9 10ug/ml,混勻后,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40小時。培養(yǎng)結束后,對slanDC做表面染色,結束后應用LSRⅡ檢測slanDC成熟功能及Tim-3表達的影響。6、人重組Gal-9對slanDC分泌細胞因子的影響,取0.5×10~6/管PBMC,分別是空白對照組、陽性對照組、加重組Gal-9組。每管加入R10培養(yǎng)基500ul,加入LPS 500ug/ml、Gal-9 10ug/ml,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)結束后對slanDC做表面染色,4℃避光染色30min,離心,4℃避光破膜30min,結束后,加入1ml/管破膜洗液離心,重復2次。染slanDC胞內分泌的IL-12,4℃避光染色30min。結束后,應用LSRⅡ檢測人重組Gal-9對slanDC分泌細胞因子的影響。7、統(tǒng)計數學分析。應用Graphpad7.03、SPSS軟件包進行統(tǒng)計分析和圖形制作,不同組之間t檢驗,P0.05為有統(tǒng)計學意義。結果:1、HIV-1感染者、健康對照組slanDC表面、胞內均表達Gal-9,且胞內Gal-9的表達水平均較表面表達水平高;HIV-1感染者slanDC表面Gal-9的表達水平較健康對照組高;HIV-1感染者slanDC胞內Gal-9的表達水平較健康對照組低。2、HIV-1感染者、健康對照組slanDC表面均表達Tim-3,HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表達水平較健康對照組低。重組Gal-9、LPS均使HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表達水平增加。3、HIV-1感染者slanDC表面CD40、CD80、CD83的表達水平較健康對照組slanDC表面CD40、CD80、CD83的表達水平低。4、HIV-1感染者slanDC分泌細胞因子IL-12較健康對照組slanDC分泌的細胞因子IL-12水平低。5、重組Gal-9使HIV-1感染者slanDC表面CD40、CD80、CD83的表達水平下降。6、重組Gal-9、LPS使HIV-1感染者slanDC分泌細胞因子IL-12下降。7、健康對照組、HIV-1感染者mDC、pDC表面、胞內均表達Gal-9,且胞內表達水平較表面表達水平高,破膜、破核后Gal-9表達水平無明顯變化。8、HIV-1感染者、健康對照組mDC表面均表達Tim-3,且HIV-1感染者mDC表面Tim-3的表達水平較健康對照組呈下降趨勢;HIV-1感染者、健康對照組pDC表面均表達Tim-3,且HIV-1感染者pDC表面Tim-3的表達水平較健康對照組下降;HIV-1感染者、健康對照組mDC表面Tim-3的表達水平較slanDC、pDC高;HIV-1感染者、健康對照組slanDC表面Tim-3的表達水平較pDC高。結論:HIV-1感染者slanDC表面Gal-9的表達增加,胞內Gal-9的表達降低。HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表達降低,重組Gal-9可使HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表達水平增加。除此之外,重組Gal-9還可使HIV-1感染者slanDC表面CD40、CD80、CD83的表達水平及slanDC分泌細胞因子IL-12的水平下降,抑制slanDC的成熟及分泌細胞因子功能。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R512.91
【圖文】：

加入到 Ficol 液面上，室溫，400g，升速 5/降速 0，離心 30min。從上到下分為 4 層：血漿、PBMC 層（Buffy Coat）、淋巴細胞及粒細胞層。將移液管尖端固定在 PBMC 層上方一點，將 PBM個新的 50ml 離心管中，加 PBS 至 45ml。室溫，300g，升/降速均為離心結束后，棄上清于高壓滅菌桶中，重懸沉淀細胞，平均分配至300g，升/降速均為 5，再次離心 5min。取 1×106細胞檢測 slanD胞表面 Gal-9 及 Tim-3 的表達，取 4×106細胞用于破膜及破核檢pDC胞內Gal-9的表達。取0.5×106細胞用于檢測外源性Gal-9對slCD40、CD80 及 CD83 表達的影響。取 0.5×106細胞用于檢測外源分泌細胞因子 IL-12 的影響。2.3.3 slanDC、mDC、pDC 的圈門策略

中國醫(yī)科大學碩士學位論文HLA-DR+的細胞為 slanDC（p2）分別定義 CD11c+HLA-DR+、CD123+mDC（P3）、pDC（P4）。2.3.4 slanDC、mDC、pDC 表面 Gal-9、Tim-3 的表達標記好流式管，取 1×106/管 PBMC 對 slanDC、mDC、pDC 表達的做表面染色：HLA-DR-APC-Cy7、M-DC-8-FITC、CD11c-BV421、CGal-9-PE、Tim-3-PE-Cy7，均為 5ul/管�；靹蚝�，4℃避光染色 30mi入 2mlPBS，室溫，300g，升 5/降 5，離心 5min，離心后棄上清，重懸細胞及 200ulEDTA 后應用 LSRⅡ流式細胞儀進行檢測，F(xiàn)lowJo 進行分析略如圖 2 所示：

7圖 3 slanDC、mDC、pDC 胞內 Gal-9 的測定 為淋巴細胞及單核細胞與單核細胞及淋巴細胞之間的細胞，以 p1 為門，定義 MR+的細胞為 slanDC（p2），定義 CD11c+HLA-DR+、CD123+HLA-DR+細胞為pDC（P4）。再以 p2、p3、p4 為門分析 slanDC、mDC、pDC 胞內、核內 Gal-9 的重組 Gal-9 對 slanDCCD40、CD80、CD83 及 Tim-3 表達的影響記好流式管，取 0.5×106/管 PBMC，分別是空白對照組、陽性對照組、-9 組。每管加入 R10 培養(yǎng)基 500ul，加入 LPS 500ug/ml、Gal-9 10ug/ml，破膜對照 破膜 破核對照破核

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