【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)在當(dāng)今依舊是一個全球性的重要公共衛(wèi)生問題。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起結(jié)核病的病原體,MTB與其宿主巨噬細胞(Macrophages,Mφ)的相互作用對結(jié)核病的病理發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。目前研究中采用的巨噬細胞多為腫瘤細胞系或外周血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)來源的巨噬細胞,其存在著因遺傳結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致功能缺失或細胞獲取困難等問題。誘導(dǎo)多能干細胞(Induced pluripotent stem cells,iPS)及定向誘導(dǎo)分化技術(shù)的出現(xiàn)為體外獲取巨噬細胞提供了途徑,為最終深入揭示巨噬細胞抗結(jié)核免疫機制提供了新的途徑。研究已證實,在MTB與巨噬細胞相互作用的過程中,細胞自噬發(fā)揮著重要的作用,但具體機制并不清楚。為了探討自噬在人誘導(dǎo)多能干細胞(human induced pluripotent stem cells,hiPS)來源的巨噬細胞(hiPS-Mφ)和THP-1來源的巨噬細胞(THP-1-Mφ)中抗結(jié)核免疫的異同,本研究首先利用類胚體(Embryonic body,EB)分化誘導(dǎo)法將hiPS細胞在體外誘導(dǎo)分化為巨噬細胞(hiPS-Mφ),并對獲得的巨噬細胞樣細胞進行形態(tài)學(xué)和生物學(xué)功能鑒定。結(jié)果證實hiPS-Mφ具有巨噬細胞所特有的特征,包括Giemsa染色為紫色、具有吞噬墨水能力,說明通過EB誘導(dǎo)方法可獲得具有生物學(xué)功能的巨噬細胞。在此基礎(chǔ)上,分別提取結(jié)核分枝桿菌弱毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)感染的hiPS-Mφ和THP-1-Mφ細胞的總RNA,通過高通量測序技術(shù)分析基因表達的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與hiPS-Mφ相比,BCG感染hiPS-Mφ后有832個基因表達有顯著性差異(P0.05),其中包括572個基因顯著上調(diào),260個基因顯著下調(diào);與THP-1-Mφ相比,BCG感染THP-1-Mφ后有397個基因表達有顯著性差異(P0.05),其中包括211個基因顯著上調(diào),186個基因顯著下調(diào)。差異表達的基因KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),BCG感染hiPS-Mφ與THP-1-Mφ后,在結(jié)核病、Toll樣受體、TNF、P13K-AKT、吞噬體、結(jié)節(jié)樣受體、NF-kappaB、mTOR、MAPK、IL-17、細胞因子-細胞因子受體互作、趨化因子及自噬和凋亡通路都有不同程度的富集。利用掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope,SEM)、透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)和激光共聚焦顯微鏡觀察BCG感染后hiPS-Mφ和THP-1-Mφ細胞的亞顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BCG感染hiPS-Mφ與THP-1-Mcφ后,細胞表面發(fā)生皺縮、裂解等現(xiàn)象,同時細胞內(nèi)自噬體數(shù)目增多;用表達mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒感染細胞,在激光共聚焦顯微鏡下觀察到BCG感染的hiPS-Mφ和THP-1-Mφ后細胞自噬體增多。最后,通過qPCR和Western Blot檢測證實,與自噬抑制劑6-氨基-3-甲基嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)處理組比較,BCG 感染 hiPS-Mcφ 和 THP-1-Mcφ 后顯著增加了自噬相關(guān)基因LC3B的表達(P0.01),同時抑制了自噬相關(guān)基因GABARAPL2和P62的表達(P0.01)。并初步證實BCG感染后通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達進而促進自噬的發(fā)生。但在不同來源的巨噬細胞中發(fā)現(xiàn),BCG感染后誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因的表達存在有一定的差異,表現(xiàn)在hiPS-Mφ中的DDIT4和EXOC8顯著上調(diào)(P0.01),而THP-1-Mφ中的RAB7B和CTSD顯著下調(diào)(P0.01),說明不同來源的巨噬細胞在BCG誘導(dǎo)自噬調(diào)控機制可能存在有差異�？傊�,本研究通過EB分化的方法,成功獲得了 hiPS來源的巨噬細胞。通過轉(zhuǎn)錄組測序分析、qPCR和WB驗證及細胞亞顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn),BCG感染hiPS-Mφ和THP-1-Mφ后通過調(diào)控自噬相關(guān)基因表達促進了細胞自噬的發(fā)生;但BCG感染不同來源的巨噬細胞誘導(dǎo)自噬發(fā)生的機制也存在有一定的差別,此結(jié)果為進一步研究自噬在巨噬細胞抗結(jié)核免疫機制中的作用提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R52
【圖文】：

（Ａ）：培養(yǎng)ｈｉＰＳ；邋（Ｂ）：邋ｈｉＰＳ長滿；（Ｃ）：邋ＥＢ形成第２ｄ；邋（Ｄ）：邋ＥＢ培養(yǎng)到５邋ｄ左右，開始成熟；（Ｅ）：逡逑添加Ｍ－ＣＳＦ和ＩＬ－３，邋ＥＢ開始逐漸貼壁；（Ｆ）：邋ＥＢ幾乎完全貼壁，開始朝單核細胞分化；（Ｇ）：培養(yǎng)逡逑皿中逐漸有懸浮細胞產(chǎn)生，每４－５邋ｄ收集一次懸浮細胞，并更換新鮮Ｍｏｎｏｃｙｔｅ培養(yǎng)基；（Ｈ）：收集懸逡逑浮細胞，并添加原先兩倍濃度的Ｍ－ＣＳＦ和ＩＬ－３刺激單核細胞向巨噬細胞分化；（Ｉ）：收集的具有典型逡逑巨噬細胞培形態(tài)特征的細胞。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１邋ｈｉＰＳ邋ｉｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｔｏ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ邋ｉｎｔｏ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ逡逑（Ａ）：邋ｈｉＰＳ邋ｃｕｌｔｕｒｅ；邋（Ｂ）：邋ｈｉＰＳ邋ｏｖｅｒｇｒｏｗｎ；邋（Ｃ）：邋ＥＢ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋２ｎｄ；邋（Ｄ）：邋ＥＢ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｆｏｒ邋５邋ｄａｙｓ，邋ＥＢ邋ｂｅｇａｎ邋ｔｏ逡逑ｍａｔｕｒｅ；邋（Ｅ）：邋Ａｄｄｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｍ－ＣＳＦ邋ａｎｄ邋ＩＬ－邋３，邋ＥＢ邋ｂｅｇａｎ邋ｔｏ邋ｇｒａｄｕａｌｌｙ邋ｇｒｏｗ邋ａｄｈｅｒｅｎｔ；邋（Ｆ）：邋ＥＢ邋ｉｓ邋ａｌｍｏｓｔ逡逑ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ邋ａｔｔａｃｈｅｄ邋ａｎｄ邋ｂｅｇｉｎｓ邋ｔｏ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ邋ｉｎｔｏ邋ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ；邋（Ｇ）：邋Ｇｒａｄｕａｌｌｙ邋ｐｒｏｄｕｃｅ邋ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ邋ｃｅｌｌｓ，逡逑ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ邋ｃｅｌｌｓ邋ｎｅｅｄ邋ｔｏ邋ｂｅ邋ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ邋ｅｖｅｒｙ邋４－５邋ｄａｙｓ，邋ａｎｄ邋ａｄｄｉｎｇ邋ｆｒｅｓｈ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｏｆ邋Ｍｏｎｏｃｙｔｅ；邋（Ｈ）：邋Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ逡逑ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｎｄ

（Ａ）ｈｉＰＳ－Ｍｃｐ；邋（Ｂ）ＴＨＰ－ｌ－Ｍｃｐ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２邋Ｇｉｍｅｓａ邋ｓｔａｉｎ邋（Ｂａｒ邋＝邋１００邋ｐｍ）逡逑（Ａ）邋ｈｉＰＳ－Ｍ（ｐ；邋（Ｂ）邋ＴＨＰ－１邋－Ｍ（ｐ逡逑３．３吞噬功能檢測逡逑通過對獲得的具有巨噬細胞樣的細胞進行墨水吞噬，測定其吞噬墨水顆粒水平，進逡逑而判斷其吞噬能力，結(jié)果如圖３．３所示，ｈｉＰＳ和ＴＨＰ－１來源的巨噬細胞樣的細胞的細胞逡逑質(zhì)中都有墨汁顆粒，表明這兩種來源的巨噬細胞樣細胞均具有吞噬功能。逡逑．、、？邋Ｖ－邋＊邐ｒ邐Ａ－邐必－逡逑，．：、＇邋灟．．，、＇．逡逑

邐自噬在ｈｉＰＳ和ＴＨＰ－１來源巨噬細胞抗結(jié)核免疫作用的比較研究逡逑？邋？邐ｄ撕４逡逑圖３．２邋Ｇｉｍｅｓａ染色（標(biāo)尺示１００邋ｆｉｎｉ）逡逑（Ａ）ｈｉＰＳ－Ｍｃｐ；邋（Ｂ）ＴＨＰ－ｌ－Ｍｃｐ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２邋Ｇｉｍｅｓａ邋ｓｔａｉｎ邋（Ｂａｒ邋＝邋１００邋ｐｍ）逡逑（Ａ）邋ｈｉＰＳ－Ｍ（ｐ；邋（Ｂ）邋ＴＨＰ－１邋－Ｍ（ｐ逡逑３．３吞噬功能檢測逡逑通過對獲得的具有巨噬細胞樣的細胞進行墨水吞噬，測定其吞噬墨水顆粒水平，進逡逑而判斷其吞噬能力，結(jié)果如圖３．３所示，ｈｉＰＳ和ＴＨＰ－１來源的巨噬細胞樣的細胞的細胞逡逑質(zhì)中都有墨汁顆粒，表明這兩種來源的巨噬細胞樣細胞均具有吞噬功能。逡逑．、、？邋Ｖ－邋＊邐ｒ邐Ａ－邐必－逡逑，．：、＇邋灟，．心．，、＇．逡逑．％９－，，邋ｉｆ邋／邋＇邋＾邋－邐、

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本文編號：2761682