【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB,以下簡稱結(jié)核菌)引起的傳染病,全球約三分之一的人被結(jié)核菌潛伏感染。每年約900萬新增結(jié)核病患者,導致約150萬人死亡,結(jié)核病嚴重威脅人類健康。中國是結(jié)核病高負擔國家,結(jié)核病是我國的重點防治對象。早發(fā)現(xiàn),早治療是防控結(jié)核病的關(guān)鍵所在。結(jié)核病的診斷主要依靠傳統(tǒng)的MTB抗酸染色法和MTB培養(yǎng)技術(shù)。但前者的靈敏度較差,后者耗時較長,不能滿足如今對結(jié)核病快速診斷的需求。免疫學診斷,分子診斷以及影像學診斷方法方便快捷,但對結(jié)核病診斷的敏感性有待提高。盡管在結(jié)核病的診斷和治療方面取得了巨大的進步,但及時、精確的診斷結(jié)核病仍然存在諸多困難。為了達到消滅結(jié)核病的目的,我們需要對結(jié)核病有更深層次的認識。數(shù)據(jù)科學,信息技術(shù)和生物技術(shù)的交叉融合,大數(shù)據(jù)的產(chǎn)生,給我們提供了一個對抗結(jié)核病的新途徑。我們能從更宏觀和更微觀的角度來了解結(jié)核病的致病機理、MTB與人類基因的相互關(guān)系和耐藥MTB的產(chǎn)生,開辟新的結(jié)核病診斷和治療方法。面對結(jié)核病防治工作的難題,世界衛(wèi)生組織提出新的理想的結(jié)核病診斷方法應使用易收集的非痰樣本(如血液,尿液),診斷方法對兒童和細菌共感染者敏感性高,且可用于療效監(jiān)測。血液樣本易收集,易定量,基于血液樣本的結(jié)核病分子診斷方法有望滿足其要求,但目前缺少相關(guān)診斷標志物的研究。測序技術(shù)飛速發(fā)展,測序成本降低,芯片技術(shù)不斷普及,基因表達譜數(shù)據(jù)量增長迅猛。公共數(shù)據(jù)庫如美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)的基因表達數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)中存儲有大量人感染結(jié)核分枝桿菌的基因表達譜數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)尚未被完全利用,背后蘊含豐富的價值有待進一步挖掘,是尋找結(jié)核病診斷標志分子的一條新的途徑。本研究檢索NIH GEO數(shù)據(jù)庫,從中篩選出6個含有結(jié)核病人外周血單核細胞基因表達譜數(shù)據(jù)集,用于挖掘結(jié)核病診斷標識基因。其中GSE19491作為發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集,GSE40553,GSE56153,GSE42834,GSE39941和GSE37250作為驗證數(shù)據(jù)集。首先,利用R語言對GSE19491的原始數(shù)據(jù)進行預處理,計算差異表達基因,構(gòu)建WGCNA共表達網(wǎng)絡,分析基因表達變化趨勢,通過比較分析得到與結(jié)核病相關(guān)的63個基因,功能富集分析發(fā)現(xiàn)它們與人免疫應答有關(guān);然后對這63個基因進一步篩選,利用結(jié)核病人和健康人的血液樣本進行RT-PCR驗證,最終確定4個在結(jié)核病人與健康人血液中的差異表達的基因,它們分別是:UBE2L6(Ubiquitin/ISG15-conjugating enzyme E2 L6),BATF2(Basic leucine zipper transcriptional factor ATF-like),SERPING1(Plasma protease C1 inhibitor)和VAMP5(Vesicle-associated membrane protein 5),分別與泛素化、免疫細胞分化、補體活化和囊泡運輸有關(guān);最后,利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)對這4個基因在包含不同條件的共約1000個樣本的5個獨立數(shù)據(jù)集中進行可靠性驗證,平均AUC=0.86,特異性81%,敏感性86%,四個基因的表達量還隨著治療進程顯著降低。BATF2,UBE2L6,VAMP5和SERPING1是潛在的結(jié)核病診斷和治療效果監(jiān)測的標志物。本研究結(jié)果已經(jīng)申報PCT專利(PCT/CN2019/080563,結(jié)核病標志物在結(jié)核病診斷和療效評估中的運用)。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R52
【圖文】：

第 4 章 實驗結(jié)果與分析第 4 章 實驗結(jié)果與分析據(jù)預處理結(jié)果 數(shù)據(jù)庫下載 GSE19491 原始數(shù)據(jù)，進行芯片預處理后，篩選表達探針，去除未注釋探針，對于多個探針對應一個基因的達值作為基因最終表達值。最終，我們得到含有 19229 個基 156 個樣本。GSE19491 經(jīng)處理后，數(shù)據(jù)集中各樣本基因表可用于后續(xù)分析（圖 4-1）。

19491 中 PTB - HC 和 PTB - LTB 的差異表達基因。（A）火山圖展示 PTB -因情況，p < 0.05，且|log2FC| > 0.8 為差異基因；（B）PTB - HC 和 PTB - LTB 共有 117 個基因在 GSE19491 中的表達值繪制聚類熱圖。edifferentially expressed genes in PTB comparedwith HCandLTB in G ofdifferentially expressed genes at adjusted p <0.05 and |log2FC|>0.8 for PTB-HC and PTdifferentially expressed genes shared by PTB-HC and PTB-LTB. (C) Heatmap of thgene expression value in the GSE19491.A 共表達網(wǎng)絡分析離群樣本的去除491 包含 19229 個基因的表達情況，進行 WGCNA 分析前有因進行過濾，利用各個基因表達量的絕對中位差過濾，最終保構(gòu)建共表達網(wǎng)絡。A 的網(wǎng)絡圖符合無尺度網(wǎng)絡特征，容易受異常樣本影響，通過氏距離進行層次聚類，根據(jù)聚類樹高度移除離群樣本。在移除

SE19491 樣本層次聚類樹。（A）移除離群樣本前的層次聚類樹；（B）移除離群樣本4-3. Hierarchical clustering tree of GSE19491. The hierarchical clustering tree (A) beving the outlier sample.閾值篩選建加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡，將基因間相似矩陣轉(zhuǎn)化為鄰接矩陣時，依賴ft-thresholdingpower，以下用 β 表示）的選擇。參數(shù) β 能強化強相關(guān)的相關(guān)的基因，使網(wǎng)絡符合無尺度網(wǎng)絡特征，更具有生物學意義。如易發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因，β 過高，用以形成模塊的基因會很少。無尺度網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)中，節(jié)點連接度頻數(shù)分布滿足 p(k) ~ k-y的q 代表在不同 β 下無尺度網(wǎng)絡的擬合指數(shù)，即節(jié)點連接度頻數(shù)的對點出現(xiàn)的概率的對數(shù) log(p(k))之間的相關(guān)性。SFT.R.sq 可用來衡量網(wǎng)尺度網(wǎng)絡模型，SFT.R.sq 越接近 1，說明越無尺度網(wǎng)絡特征。我們計下網(wǎng)絡的 SFT.R.sq，平均連接度（mean.k），中位數(shù)（median.k）和.k）。觀察不同 β 下的 SFT.R.sq 和 mean.k 值（圖 4-4），發(fā)現(xiàn)可選擇 β

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本文編號：2761630