【摘要】：目的:探討乙型肝炎病毒X蛋白對cGAS信號通路的調(diào)控作用及其機(jī)制。方法:1.分別用pIFNβ-luc、pRL-PK質(zhì)粒與pcGAS-Flag、pSTING-HA和pHBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收集細(xì)胞裂解液,運(yùn)用多功能酶標(biāo)分析儀檢測熒光素酶活性,分析IFNβ的表達(dá)水平及HBX對IFNβ表達(dá)水平的影響。2.用pcGAS-Flag、pSTING-HA和pHBX質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,分別檢測各個(gè)時(shí)間點(diǎn)IFNβmRNA的表達(dá)水平及HBX對IFNβmRNA表達(dá)水平的影響。3.運(yùn)用Western-blot及熒光定量PCR檢測HepG2、HepG2.215、L02和SMMC-7721各個(gè)肝源細(xì)胞株中cGAS和STING的蛋白及mRNA表達(dá)水平。4.用pcGAS-Flag、pSTING-HA和pHBX質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,提取蛋白并運(yùn)用Western-blot分析磷酸化及二聚體形態(tài)的IRF3的表達(dá)水平的變化。5.用pHBX分別與pIRF3-Flag或pSTING-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收集細(xì)胞裂解液,運(yùn)用多功能酶標(biāo)分析儀檢測相對熒光素酶活性,分析pIRF3-Flag和pSTING-HA相應(yīng)誘導(dǎo)的IFNβ表達(dá)水平及HBX對IFNβ表達(dá)水平的影響,探究HBX調(diào)控cGAS誘導(dǎo)的DNA信號通路的作用位點(diǎn)。6.以SMMC-7721細(xì)胞為模型,用pHBX質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞,提取蛋白并運(yùn)用Western-blot分析HBX對cGAS蛋白表達(dá)量的影響;提取RNA并運(yùn)用熒光定量PCR分析HBX對cGAS mRNA表達(dá)量的影響。7.用pHBX質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞,運(yùn)用免疫共沉淀及熒光共定位分析HBX與cGAS的相互作用。8.利用3MA、Rapamycin處理SMMC-7721細(xì)胞或者用pHBX質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞,分別檢測cGAS及LC3-II蛋白表達(dá)量的變化;在SMMC-7721細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pGFP-LC3和pHBX或者用3MA、Rapamycin處理轉(zhuǎn)染了pGFP-LC3質(zhì)粒的細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察自噬顆粒,計(jì)數(shù)自噬細(xì)胞數(shù),計(jì)算自噬發(fā)生率。結(jié)果:1.HBX負(fù)調(diào)控由cGAS介導(dǎo)的IFNβ的表達(dá)。2.在HepG2、HepG2.215、L02和SMMC-7721幾個(gè)肝源細(xì)胞株中,均有STING的表達(dá),但只有L02和SMMC-7721細(xì)胞表達(dá)cGAS。3.HBX的抑制作用是通過cGAS-STING-IRF3-IFNβ通路實(shí)現(xiàn),且HBX主要通過作用于STING的上游環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)控。4.HBX對cGAS的蛋白表達(dá)量和功能均有抑制作用,但對cGAS的mRNA水平無影響。5.HBX與cGAS在細(xì)胞內(nèi)共定位,且兩者相互結(jié)合。6.HBX通過增強(qiáng)cGAS的自噬促進(jìn)cGAS的降解,從而負(fù)調(diào)控cGAS信號通路。結(jié)論:HBX負(fù)調(diào)控cGAS信號通路可能因?yàn)閮煞N因素:一方面HBX與cGAS相互結(jié)合,競爭抑制DNA與cGAS的結(jié)合;另一方面HBX增強(qiáng)cGAS的自噬性降解。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R512.62
【圖文】：

光素酶活性為單位進(jìn)行表示。我們發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcGAS-Flag或者小劑量的pSTING-HA未能激活I(lǐng)FNβ啟動子活性，共轉(zhuǎn)染pcGAS-Flag和pSTING-HA能夠顯著激活I(lǐng)FNβ啟動子的活性（圖1.1）。圖1.1在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)IFNβ的表達(dá)，并運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因分析IFNβ的表達(dá)水平。Fig.1.1 HEK293 cells were transfected with the corresponding expression plasmid to induce theexpression of IFNβ, and the expression level of IFNβ was analyzed by the dual luciferase reportergene.2.1.2 HBX 負(fù)調(diào)控 cGAS 誘導(dǎo)產(chǎn)生的 IFNβ水平在此基礎(chǔ)上，我們將pcDNA3.1-HBx或者空載體pcDNA3.1與誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收集細(xì)胞裂解液檢測相對熒光素酶活性，結(jié)果顯示HBX能夠顯著抑制β干擾素啟動子的活性，且抑制效率與HBX的濃度呈正相關(guān)（圖1.2）。同時(shí)，將pcDNA3.1-HBx或者空載體pcDNA3.1與pcGAS-Flag、pSTING-HA共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，24小時(shí)后收集細(xì)胞提取RNA

染入HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收集細(xì)胞裂解液檢測相對熒光素酶活性，結(jié)果顯示HBX能夠顯著抑制β干擾素啟動子的活性，且抑制效率與HBX的濃度呈正相關(guān)（圖1.2）。同時(shí)，將pcDNA3.1-HBx或者空載體pcDNA3.1與pcGAS-Flag、pSTING-HA共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，24小時(shí)后收集細(xì)胞提取RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IFNβmRNA，我們發(fā)現(xiàn)HBX對IFNβ的mRNA水平也有相同的影響（圖1.3）。圖1.2運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因分析轉(zhuǎn)染pHBx后對cGAS誘導(dǎo)的IFNβ表達(dá)水平的影響。Fig.1.2 Effect of pHBx on cGAS-induced IFNβ expression by dual luciferase reporter gene assay.

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文19圖1.3 運(yùn)用熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)染pHBx后對cGAS誘導(dǎo)的IFNβmRNA表達(dá)水平的影響。Fig.1.3 Effect of pHBx on cGAS-induced IFNβ mRNA expression by real-time PCR.先天性免疫應(yīng)答誘導(dǎo)產(chǎn)生的I型干擾素發(fā)生于病毒感染的早期。為了驗(yàn)證IFNβ的達(dá)峰時(shí)間，我們在HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pcGAS-Flag、pSTING-HA后分別在0h、6h、12h、18h、24h檢測誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFNβ的mRNA水平，并且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx觀察抑制效果。我們發(fā)現(xiàn)IFNβmRNA在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能被HBX抑制，且IFNβmRNA的表達(dá)水平在12小時(shí)至18小時(shí)之間達(dá)到高峰(圖1.4）。這些結(jié)果證實(shí)，cGAS介導(dǎo)的信號通路能夠誘導(dǎo)IFNβ的表達(dá)，該誘導(dǎo)作用于轉(zhuǎn)染后12小時(shí)至18小時(shí)之間達(dá)到高峰。HBX能夠顯著抑制由cGAS信號通路誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFNβ，且抑制效果與HBX呈濃度依耐性。圖1.4 運(yùn)用熒光定量PCR分析HBx在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對IFNβ表達(dá)水平的影響。Fig.1.4 Fluorescence quantitative PCR was used to analyze the effect of HBx on the expression ofIFNβ at various time points.2.1.3 各肝細(xì)胞株中 GAS、STING 的表達(dá)水平HBV為嗜肝的DNA病毒，為了更好的研究HBX的作用

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王艷巧;陳傳杰;張光文;;乙型肝炎病毒相關(guān)原發(fā)性肝癌的危險(xiǎn)因素分析[J];肝臟;2019年10期

2 杜希芬;;電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在乙型肝炎病毒臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用效果[J];心理月刊;2019年13期

3 買木熱·肉孜;阿不來提·阿不都熱合木;;拉米夫定治療乙型肝炎病毒引起失代償肝病臨床分析[J];大家健康(學(xué)術(shù)版);2015年06期

4 刀琴;;不同乙肝治療方法對抗結(jié)核治療中的肝功保護(hù)作用[J];健康之路;2016年09期

5 戴娘欽;;siRNA對乙型肝炎病毒抵抗的研究進(jìn)展[J];中國醫(yī)藥指南;2012年02期

6 魏茂周;鄭嶸;董安山;王華麗;;胸腺肽α1預(yù)防乙型肝炎病毒再激活臨床研究[J];中國當(dāng)代醫(yī)藥;2012年07期

7 李鋼;胡明道;;乙型肝炎病毒X蛋白在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用[J];醫(yī)學(xué)綜述;2012年11期

8 陳惠文;劉壬通;羅宜招;賀勇鋒;;乙型肝炎病毒外膜大蛋白檢測的臨床應(yīng)用[J];中國醫(yī)藥指南;2010年22期

9 劉魚;王憬惺;李武平;黃毅;曾沛斌;何苗;;HIV感染獻(xiàn)血者中乙型肝炎病毒的感染特征研究[J];中國輸血雜志;2010年S1期

10 趙燕飛;姜新華;蘭天麗;;乙型肝炎病毒大蛋白檢測的臨床意義及應(yīng)用價(jià)值[J];中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2010年12期

相關(guān)會議論文 前10條

1 白羽;仇麗娟;陶宣榮;李小慶;張梅英;李清祥;;乙型肝炎病毒C區(qū)基因變異及研究進(jìn)展[A];第七屆中國臨床微生物學(xué)大會暨微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2016年

2 王煥玲;謝靜;李翊嘉;韓揚(yáng);邱志峰;李雁凌;宋曉t

本文編號：2760711