【摘要】：目的:肝細胞肝癌是全球排名第五位的常見惡性腫瘤,其死亡率排在腫瘤死亡率的第三位。全球每年約有60萬人死于肝癌。目前,已經(jīng)確定的肝癌發(fā)病的危險因素中,乙型肝炎病(HBV)毒感染為最主要的危險因素。在世界各地,約有2.48億人患有慢性乙型肝炎,在中國,有9500萬人患有乙型病毒性肝炎,其中一些患者會緩慢發(fā)展成慢性乙型肝炎后肝硬化進而發(fā)展成肝細胞肝癌。目前,肝癌的診治還存在早期診斷困難、缺乏有效治療、復發(fā)轉(zhuǎn)移率偏高、缺少創(chuàng)新藥物等棘手問題,因此,對肝癌分子發(fā)病機制的研究和肝癌診治新技術(shù)新藥物的研發(fā)顯得尤為重要。ALDH1A3是醛脫氫酶(ALDH)家族中的一員,主要負責將全反式視黃醛氧化成視黃酸而參與人體細胞的各種生理過程。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ALDH1A3表達受許多因素調(diào)節(jié),并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后相關(guān)。并且,ALDH1A3在多種腫瘤中表現(xiàn)出腫瘤干細胞(CSC)特征,與癌細胞的集落形成、球形成、腫瘤發(fā)生和血管生成活性密切相關(guān)。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾的一種重要方式,在維持基因組DNA的基因印記、染色體的穩(wěn)定、重復基因的轉(zhuǎn)錄沉默中起著重要作用。肝細胞肝癌表觀遺傳學上可發(fā)生廣泛的DNA甲基化,且被證明與HBV感染相關(guān),但HBV感染誘導DNA甲基化程度的改變在肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未闡明。本研究利用肝癌組織臨床標本及兩種肝癌細胞系,采用甲基化芯片、甲基化PCR、熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù),檢測ALDH1A3基因在乙肝相關(guān)性肝細胞肝癌中甲基化程度及表達水平,初步探討ALDH1A3基因與乙肝病毒感染性肝細胞肝癌的關(guān)系。方法:1.收集6例HBV高拷貝肝癌患者肝癌組織和6例無HBV感染肝癌患者肝癌組織標本均提取DNA,采用甲基化芯片技術(shù)對兩組樣本進行對比分析,篩選差異甲基化基因及差異甲基化位點,比較兩組標本的整體甲基化狀態(tài)及ALDH1A3基因甲基化程度的高低。2.收集并提取3例HBV高拷貝肝癌患者和3例無HBV感染肝癌患者的肝癌組織DNA,培養(yǎng)并提取表達HBV基因的HepG2.2.15肝癌細胞和HBV陰性的HepG2肝癌細胞的細胞DNA,根據(jù)芯片結(jié)果分析的差異甲基化位點設(shè)計ALDH1A3啟動子區(qū)引物,采用甲基化特異性PCR(MSP)方法,在組織和細胞中進一步驗證ALDH1A3基因啟動子區(qū)甲基化差異。3.提取上一步驟中兩組肝癌組織及兩株肝癌細胞的總RNA和蛋白,采用Real-time PCR和Westernblot方法,分別對比組織及細胞中ALDH1A3基因在mRNA和蛋白水平的表達情況。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA),進行正態(tài)及方差齊性檢驗,檢驗以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1.甲基化芯片分析結(jié)果顯示:HBV高拷貝肝癌組織DNA整體呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài),并且從存在甲基化差異的基因中篩選出ALDH1A3基因,呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。2.甲基化特異性PCR結(jié)果顯示:HBV高拷貝肝癌組織ALDH1A3啟動子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化,而HBV陰性肝癌組織ALDH1A3啟動子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化,差異具有顯著意義(P0.01);HepG2.2.15細胞ALDH1A3啟動子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化,而HepG2細胞ALDH1A3啟動子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化,差異具有顯著意義(P0.01)。3.Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示:HBV高拷貝肝癌組織較HBV陰性肝癌組織、HepG2.2.15肝癌細胞較HepG2肝癌細胞的ALDH1A3基因,在mRNA水平和蛋白水平的表達均升高,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞肝癌全基因組呈現(xiàn)低甲基化且HBV介導了ALDH1A3基因啟動子區(qū)的去甲基化及高表達。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R735.7;R512.62
【圖文】：

例無 HBV 感染肝癌患者肝癌組織 DNA 樣本，非監(jiān)督聚類分析可見BV 感染狀態(tài)不同，差異甲基化位點的熱圖聚類有顯著差別（Fig.1） HBV 高拷貝組與 HBV 陰性組差異甲基化位點和基因數(shù)目進行統(tǒng)計存在差異位點 14,454 個，高甲基化位點 581 個，低甲基化位點 13,，共發(fā)現(xiàn) 3,436 個基因存在甲基化水平差異，甲基化程度升高基因 ，甲基化程度降低基因 3023 個（Fig.2），結(jié)果提示：HBV 高拷貝肝織 DNA 整體呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，并且從甲基化差異基因列表中篩選LDH1A3 基因，呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。

圖 1 HBV 高拷貝組-HBV 陰性組差異甲基化位點熱圖聚類Fig.1 Cluster analysis of different gene methylation between High-copy HBVgroup and non-HBV group

Fig.2 Numbers of differentially methylated sites and DMR genes betweenhigh-copy HBV group and non-HBV group.(A)Numbers of differentiallymethylated sites.(B)Numbers of DMR genes2.甲基化特異性 PCR 驗證 ALDH1A3 啟動子區(qū)低甲基化取 3 對肝癌組織的 DNA，進行甲基化特異性 PCR（MSP）驗證ALDH1A3 啟動子區(qū)低甲基化。結(jié)果如圖 3：3 例 HBV 高拷貝肝癌組織ALDH1A3 啟動子區(qū)均呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，而 3 例 HBV 陰性肝癌組織的ALDH1A3 啟動子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，兩者差異具有顯著意義（P<0.01）；在細胞水平應(yīng)用 MSP 檢測兩株肝癌細胞 ALDH1A3 啟動子區(qū)甲基化情況，結(jié)果如圖 4：攜帶并穩(wěn)定表達 HBV 基因的 HepG2.2.15 肝癌細胞 ALDH1A3 啟動子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，而 HBV 陰性的 HepG2 肝癌細胞 ALDH1A3 啟動子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，兩者差異具有顯著意義（P<0.01）。

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7 陳e

本文編號：2760554