發(fā)布時(shí)間：2020-07-18 06:40

【摘要】：目的:肝細(xì)胞肝癌是全球排名第五位的常見惡性腫瘤,其死亡率排在腫瘤死亡率的第三位。全球每年約有60萬人死于肝癌。目前,已經(jīng)確定的肝癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素中,乙型肝炎病(HBV)毒感染為最主要的危險(xiǎn)因素。在世界各地,約有2.48億人患有慢性乙型肝炎,在中國,有9500萬人患有乙型病毒性肝炎,其中一些患者會(huì)緩慢發(fā)展成慢性乙型肝炎后肝硬化進(jìn)而發(fā)展成肝細(xì)胞肝癌。目前,肝癌的診治還存在早期診斷困難、缺乏有效治療、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率偏高、缺少創(chuàng)新藥物等棘手問題,因此,對(duì)肝癌分子發(fā)病機(jī)制的研究和肝癌診治新技術(shù)新藥物的研發(fā)顯得尤為重要。ALDH1A3是醛脫氫酶(ALDH)家族中的一員,主要負(fù)責(zé)將全反式視黃醛氧化成視黃酸而參與人體細(xì)胞的各種生理過程。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ALDH1A3表達(dá)受許多因素調(diào)節(jié),并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)。并且,ALDH1A3在多種腫瘤中表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞(CSC)特征,與癌細(xì)胞的集落形成、球形成、腫瘤發(fā)生和血管生成活性密切相關(guān)。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾的一種重要方式,在維持基因組DNA的基因印記、染色體的穩(wěn)定、重復(fù)基因的轉(zhuǎn)錄沉默中起著重要作用。肝細(xì)胞肝癌表觀遺傳學(xué)上可發(fā)生廣泛的DNA甲基化,且被證明與HBV感染相關(guān),但HBV感染誘導(dǎo)DNA甲基化程度的改變?cè)诟渭?xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未闡明。本研究利用肝癌組織臨床標(biāo)本及兩種肝癌細(xì)胞系,采用甲基化芯片、甲基化PCR、熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù),檢測ALDH1A3基因在乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞肝癌中甲基化程度及表達(dá)水平,初步探討ALDH1A3基因與乙肝病毒感染性肝細(xì)胞肝癌的關(guān)系。方法:1.收集6例HBV高拷貝肝癌患者肝癌組織和6例無HBV感染肝癌患者肝癌組織標(biāo)本均提取DNA,采用甲基化芯片技術(shù)對(duì)兩組樣本進(jìn)行對(duì)比分析,篩選差異甲基化基因及差異甲基化位點(diǎn),比較兩組標(biāo)本的整體甲基化狀態(tài)及ALDH1A3基因甲基化程度的高低。2.收集并提取3例HBV高拷貝肝癌患者和3例無HBV感染肝癌患者的肝癌組織DNA,培養(yǎng)并提取表達(dá)HBV基因的HepG2.2.15肝癌細(xì)胞和HBV陰性的HepG2肝癌細(xì)胞的細(xì)胞DNA,根據(jù)芯片結(jié)果分析的差異甲基化位點(diǎn)設(shè)計(jì)ALDH1A3啟動(dòng)子區(qū)引物,采用甲基化特異性PCR(MSP)方法,在組織和細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證ALDH1A3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化差異。3.提取上一步驟中兩組肝癌組織及兩株肝癌細(xì)胞的總RNA和蛋白,采用Real-time PCR和Westernblot方法,分別對(duì)比組織及細(xì)胞中ALDH1A3基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),進(jìn)行正態(tài)及方差齊性檢驗(yàn),檢驗(yàn)以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.甲基化芯片分析結(jié)果顯示:HBV高拷貝肝癌組織DNA整體呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài),并且從存在甲基化差異的基因中篩選出ALDH1A3基因,呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。2.甲基化特異性PCR結(jié)果顯示:HBV高拷貝肝癌組織ALDH1A3啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化,而HBV陰性肝癌組織ALDH1A3啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化,差異具有顯著意義(P0.01);HepG2.2.15細(xì)胞ALDH1A3啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化,而HepG2細(xì)胞ALDH1A3啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化,差異具有顯著意義(P0.01)。3.Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示:HBV高拷貝肝癌組織較HBV陰性肝癌組織、HepG2.2.15肝癌細(xì)胞較HepG2肝癌細(xì)胞的ALDH1A3基因,在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞肝癌全基因組呈現(xiàn)低甲基化且HBV介導(dǎo)了ALDH1A3基因啟動(dòng)子區(qū)的去甲基化及高表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R735.7;R512.62
【圖文】：

例無 HBV 感染肝癌患者肝癌組織 DNA 樣本，非監(jiān)督聚類分析可見BV 感染狀態(tài)不同，差異甲基化位點(diǎn)的熱圖聚類有顯著差別（Fig.1） HBV 高拷貝組與 HBV 陰性組差異甲基化位點(diǎn)和基因數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)存在差異位點(diǎn) 14,454 個(gè)，高甲基化位點(diǎn) 581 個(gè)，低甲基化位點(diǎn) 13,，共發(fā)現(xiàn) 3,436 個(gè)基因存在甲基化水平差異，甲基化程度升高基因 ，甲基化程度降低基因 3023 個(gè)（Fig.2），結(jié)果提示：HBV 高拷貝肝織 DNA 整體呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，并且從甲基化差異基因列表中篩選LDH1A3 基因，呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。

圖 1 HBV 高拷貝組-HBV 陰性組差異甲基化位點(diǎn)熱圖聚類Fig.1 Cluster analysis of different gene methylation between High-copy HBVgroup and non-HBV group

Fig.2 Numbers of differentially methylated sites and DMR genes betweenhigh-copy HBV group and non-HBV group.(A)Numbers of differentiallymethylated sites.(B)Numbers of DMR genes2.甲基化特異性 PCR 驗(yàn)證 ALDH1A3 啟動(dòng)子區(qū)低甲基化取 3 對(duì)肝癌組織的 DNA，進(jìn)行甲基化特異性 PCR（MSP）驗(yàn)證ALDH1A3 啟動(dòng)子區(qū)低甲基化。結(jié)果如圖 3：3 例 HBV 高拷貝肝癌組織ALDH1A3 啟動(dòng)子區(qū)均呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，而 3 例 HBV 陰性肝癌組織的ALDH1A3 啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，兩者差異具有顯著意義（P<0.01）；在細(xì)胞水平應(yīng)用 MSP 檢測兩株肝癌細(xì)胞 ALDH1A3 啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，結(jié)果如圖 4：攜帶并穩(wěn)定表達(dá) HBV 基因的 HepG2.2.15 肝癌細(xì)胞 ALDH1A3 啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，而 HBV 陰性的 HepG2 肝癌細(xì)胞 ALDH1A3 啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，兩者差異具有顯著意義（P<0.01）。

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7 陳e

本文編號(hào)：2760554