【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染及其引起的一系列相關(guān)疾病是一種嚴(yán)重影響人類健康的全球性疾病,世界各國(guó)的科學(xué)家們從不同的方面對(duì)HBV感染的有效防治進(jìn)行了大量的相關(guān)研究、探索和嘗試。乙肝疫苗、干擾素(Interferon,INF)和核苷(酸)類似物(Nucleotide analogues,Nas)是現(xiàn)階段防治慢性乙型肝炎病毒感染有效的主要手段,乙肝疫苗雖然可起到預(yù)防作用,但對(duì)已感染者、免疫耐受者和病毒逃逸株無效,而現(xiàn)階段使用的抗病毒藥物,存在副作用較大(干擾素)、易產(chǎn)生耐藥(核苷類藥物)、抗原血清轉(zhuǎn)換率低等諸多缺點(diǎn)。建立細(xì)胞模型是研究病毒感染史、生物學(xué)特性、評(píng)價(jià)藥物療效、優(yōu)化治療方案、研究高效疫苗和開發(fā)新產(chǎn)品高效便捷的技術(shù)手段�，F(xiàn)有的細(xì)胞模型包括病毒感染細(xì)胞模型、病毒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型和病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型。對(duì)于病毒感染細(xì)胞模型,雖然近年發(fā)現(xiàn)了HBV的受體分子鈉離子一�；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sodium taurocholate co-transporting polypeptide,NTCP),但其感染效率仍然較低并且操作復(fù)雜,另外由于HBV嚴(yán)格的物種和組織特異性屬性,限制了此種細(xì)胞模型的應(yīng)用,病毒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)在肝癌細(xì)胞中的病毒復(fù)制很難長(zhǎng)期保持穩(wěn)定,不適合實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化的需要,如藥物敏感試驗(yàn)。20余年來國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了可以復(fù)制和分泌HBV病毒顆粒的穩(wěn)定細(xì)胞系,如國(guó)際上公認(rèn)的Hep G2.2.15細(xì)胞和Hep AD38細(xì)胞。其他實(shí)驗(yàn)室為了滿足抗病毒耐藥變異研究的需求,也相繼建立起了耐藥突變的HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞株,但仍然缺少我國(guó)流行的(B和C基因型)HBV毒株穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系和多重耐藥細(xì)胞株;另外一些細(xì)胞株人為誘導(dǎo)的HBV突變細(xì)胞株,不能反映出病毒的自然遺傳特征。因此,建立HBV中國(guó)流行株B和C基因型穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞模型,符合我國(guó)臨床實(shí)際,對(duì)于抗病毒藥物的評(píng)價(jià)及乙肝防治方案的本土化具有積極作用。本實(shí)驗(yàn)室在前期的工作中通過聯(lián)合應(yīng)用PB轉(zhuǎn)座子及其他技術(shù)構(gòu)建了中國(guó)流行株C基因型野生株和耐藥株的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,本研究旨在對(duì)此穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析,并將其初步應(yīng)用在體外抗HBV藥效學(xué)評(píng)價(jià)上,期望該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞能夠?yàn)榭笻BV新藥藥效評(píng)價(jià)提供理想的細(xì)胞模型。目的:檢測(cè)分析本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的HBV中國(guó)流行株C基因型穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞:Hep G2.CW和Hep G2.LER細(xì)胞系的各項(xiàng)復(fù)制指標(biāo),評(píng)價(jià)該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞特性與經(jīng)典HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型的差異;用臨床常用核苷類藥物來評(píng)價(jià)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系用于藥物評(píng)價(jià)的可靠性;設(shè)計(jì)用于表達(dá)新型小發(fā)卡rna(shorthairpinrna,shrna)的慢病毒載體,并考察其用于抗乙型肝炎病毒的可行性。方法:1、hbv穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞特征分析:1)化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)hepg2.cw和hepg2.ler細(xì)胞上清hbv表面抗原(hepatitisbvirussurfaceantigen,hbsag)的表達(dá)和e抗原(hepatitisbviruseantigen,hbeag)的表達(dá);2)熒光定量rcr法檢測(cè)hepg2.cw和hepg2.ler細(xì)胞上清hbvdna的含量;3)酶聯(lián)免疫吸附法定性檢測(cè)胞內(nèi)乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的表達(dá);4)間接免疫熒光法檢測(cè)胞內(nèi)乙型肝炎病毒表面抗原的表達(dá);5)間接免疫熒光法檢測(cè)胞內(nèi)乙型肝炎病毒核心抗原的表達(dá);6)酶聯(lián)免疫吸附法定性檢測(cè)hepg2.cw和hepg2.ler細(xì)胞系細(xì)胞上清乙型肝炎病毒前s1抗原(hbvpres1)的表達(dá)。2、用臨床常用核苷類藥物來評(píng)價(jià)hepg2.cw和hepg2.ler細(xì)胞系用于藥物評(píng)價(jià)的可靠性:選用我國(guó)三種臨床常用核苷類藥物:拉米夫定(lam)、恩替卡韋(etv)、阿德福韋酯(adv),稀釋為0、0.001、0.01、0.1、1、10、100μm的一系列的濃度梯度,分別作用于hepad38(陽性對(duì)照)、hepg2.cw和hepg2.ler三種細(xì)胞系,連續(xù)正常培養(yǎng)九天后用熒光定量rcr法檢測(cè)三種細(xì)胞上清乙型肝炎病毒dna的含量。3、新型小發(fā)卡rna慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及抗乙型肝炎病毒應(yīng)用評(píng)價(jià):對(duì)慢病毒載體骨架sapi位點(diǎn)進(jìn)行突變,并將用于表達(dá)新型小發(fā)卡rna的結(jié)構(gòu)亞克隆到改造后的慢病毒載體;設(shè)計(jì)靶向hbv保守序列的shrna并克隆到該慢病毒載體,包裝含有shrna序列的重組慢病毒并進(jìn)行定量,考察單個(gè)及多個(gè)shrna結(jié)構(gòu)串聯(lián)對(duì)慢病毒滴度的影響;將重組慢病毒感染hbv穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系hepg2.cw(moi=3),用l3稻霉素(blasticidin)篩選穩(wěn)定克隆1周后,將其重新消化,并以1×105/孔接種于24孔板中,于鋪板96h后取細(xì)胞上清檢測(cè)hbsag、hbeag表達(dá)水平和hbvdna的含量。結(jié)果:1、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞特征分析結(jié)果:1)陽性對(duì)照hepg2.2.15細(xì)胞上清hbsag表達(dá)水平約為79ng/ml,hepg2.cw和hepg2.ler細(xì)胞上清hbsag表達(dá)水平約為85ng/ml和8ng/ml;2)陽性對(duì)照的hepg2.2.15細(xì)胞上清hbeag表達(dá)水平約為63ncu/ml,hepg2.cw和hepg2.ler細(xì)胞上清hbeag表達(dá)水平約為78ncu/ml和70ncu/ml;3)hepg2.cw和hepg2.ler細(xì)胞的hbvdna的含量均比陽性對(duì)照細(xì)胞hepg2.2.15高;4)hepg2.cw細(xì)胞胞內(nèi)hbsag的表達(dá)水平比陽性對(duì)照hepad38細(xì)胞高,而hbeag的表達(dá)水平就比陽性對(duì)照hepad38細(xì)胞低;hepg2.ler細(xì)胞胞內(nèi)hbsag和hbeag的表達(dá)水平均比陽性對(duì)照hepad38細(xì)胞低;5)hepg2.cw和hepg2.ler兩種細(xì)胞系均有較好的表面抗原表達(dá);6)hepg2.cw和hepg2.ler兩種細(xì)胞系均有較好的核心抗原表達(dá);7)陽性對(duì)照Hep AD38細(xì)胞上清HBV Pre S1表達(dá)水平OD值約為2.5,Hep G2.CW和Hep G2.LER細(xì)胞上清HBV Pre S1表達(dá)水平OD值約為3.5和0.8。2、用臨床常用核苷類藥物來評(píng)價(jià)Hep G2.CW和Hep G2.LER細(xì)胞系用于藥物評(píng)價(jià)的可靠性,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加,陽性對(duì)照細(xì)胞Hep AD38和待評(píng)價(jià)細(xì)胞Hep G2.CW細(xì)胞上清HBV DNA的量均出現(xiàn)均勻的下降趨勢(shì);而Hep G2.LER細(xì)胞上清HBV DNA對(duì)LAM和ETV敏感度下降,ETV的作用也僅在藥物濃度1μM之后對(duì)HBV DNA的量有一定抑制趨勢(shì),ADV在藥物濃度0.1μM時(shí)即對(duì)HBV DNA的量有明顯的抑制。3、構(gòu)建了一種用于表達(dá)新型小發(fā)卡RNA的慢病毒載體,通過設(shè)計(jì)靶向HBV保守序列的sh RNA實(shí)現(xiàn)了HBV復(fù)制的高效抑制,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)和三個(gè)sh RNA串聯(lián)效果優(yōu)于單個(gè)sh RNA。結(jié)論:1、兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系Hep G2.CW和Hep G2.LER細(xì)胞能夠穩(wěn)定支持HBV的復(fù)制和表達(dá);2、Hep G2.CW對(duì)三種臨床常用抗乙肝核苷類藥物均敏,Hep G2.LER細(xì)胞株對(duì)LAM和ETV敏感度下降;3、本文構(gòu)建的新型sh RNA慢病毒表達(dá)載體可作為防治慢性病毒感染如HBV感染的潛在有效手段之一。
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：2750599