【摘要】：第一部分 乙肝病毒慢性感染血小板動力異常研究背景及目的：血小板減少是乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)慢性感染常見的并發(fā)癥,在HBV感染疾病早期出現(xiàn)血小板減少提示疾病進展,預后不良。血小板減少與失代償期肝硬化,肝移植及死亡相關。目前關于HBV慢性感染患者的血小板減少的機制并不完善,許多因素參與了HBV慢性感染的血小板減少,而且在疾病進展不同階段,影響血小板減少的主要因素可能不同。本研究在HBV感染發(fā)展的各階段,分析血小板動力指標包括網(wǎng)織血小板(Reticulated platelet, RP),糖盞蛋白(glycocalicin, GC)及血小板生成素(thrombopoietin, TPO)的變化其表面膜蛋白CD41a及CD42a的表達情況。材料和方法：肝硬化患者肝功能按照Child-Turcotte-Pugh (CTP)評分進行分級。本研究共納入114名研究對象,其中包括：30名慢乙肝(chronic hepatitis B, CHB)患者；39名代償期肝硬化患者(Child A)其中包括20名Child A無小板減少的患者和19名Child A伴血小板減少的患者；以及45名失代償期肝硬化患者(Child B/C)均伴血小板減少。GC及TPO的分析采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法檢測。RP及CD41a及CD42a分析采用流式細胞儀檢測。結(jié)果：TPO水平在無血小板明顯減少的ChildA組開始出現(xiàn)降低,在失代償期肝硬化患者(Child B/C)組出現(xiàn)明顯降低。Child B/C組血漿TPO水平和血漿白蛋白水平明顯相關(r=0.65,p0.01)。RP及GCI在HBV慢性感染各組均明顯升高,包括慢乙肝組及Child A無血小板減少組。表達CD41a及CD42a的絕對血小板計數(shù)各組均明顯低于正常。同時表達CD41a及CD42a血小板占血小板總數(shù)的百分比(CD41a+CD42a+%)在Child B/C組明顯升高。在CHB組與Child A無血小板減少組,CD41a+CD42a+%與HBVDNA拷貝數(shù)負相關(CHB, r=-0.72, p0.01; ChildA無血小板減少組,r=-0.50,p0.05)。結(jié)論：HBV慢性感染患者在血小板數(shù)目發(fā)生減少之前,血小板的動力指標已經(jīng)發(fā)生異常。HBV慢性感染血小板減少的機制是涉及多個方面的,在慢乙肝階段可能是以破壞增多為主,在失代償期肝硬化階段,既有破壞增多也有生成的不足。第二部分Breg細胞在HBV慢性感染中的作用研究背景及目的：HBV慢性持續(xù)性感染是病毒、機體免疫等多種因素復雜作用的結(jié)果。對于HBV病毒清除最重要的是HBV特異性細胞毒性T細胞(HBV specific cytotoxic T lymphocytes, HBV-specific-CTL)的強度和效能。HBV的慢性持續(xù)性感染涉及機體固有免疫及適應性免疫,細胞免疫在病毒的清除中是十分重要的。近來研究顯示調(diào)節(jié)性B細胞(Regulatory B cell, Breg)發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)或抑制功能。有研究表明人體內(nèi)分泌白介素10 (Interleukin-10, IL-10)的CD5+B細胞是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞,關于這群細胞在病毒感染性疾病中的作用目前尚不清楚,本研究進一步明確分泌IL-10的CD5+B細胞是否參與HBV慢性感染的機制。材料和方法：本研究納入68名研究對象,其中20名健康對照,48名HBV慢性感染患者(25名慢乙肝患者(Chronic hepatitis B, CHB)及23名肝硬化(Liver cirrhosis, LC)患者),采用ELISA方法檢測血漿IL-10及丫干擾素(Interferon-γ, IFN-γ)水平,流式細胞計數(shù)檢測外周血CD5+CD19+及人類白細胞抗原A2陽性(human leucocyte antigen A2, HLA-A2)細胞表達。IL-10+CD5+CD19+細胞采用非特異性刺激細胞后細胞培養(yǎng)胞內(nèi)染色的方法檢測。采用HLA—-肽五聚體法(Pentamers)結(jié)合流式細胞技術直接檢測慢性乙肝患者外周血中的HBV-specific-CTL細胞特異性 CD8+T細胞(Pro5(?)MHC Pentamer (A*02:01/FLPSDFFPSV Pro5(?)MHC Pentamer staining of HBV core 18-27-specific T cells)。用磁珠分選出CD8+細胞和Breg細胞,體外培養(yǎng)研究兩者之間的相互作用。結(jié)果：CHB組及LC組CD5+CD19+細胞占外周單個核細胞的比例明顯高于健康對照組,分泌IFN-7的CD8+細胞比例在CHB組明顯升高,表達CD107a的CD8+細胞比例在CHB及LC組均升高。CHB組血漿IFN-y, IL-10水平升高。在48位HBV慢性感染患者中有13位HLA-A2+的患者,其中有7位患者外周血檢測到HBV-specific-CTL細胞。將這7名患者單個核細胞分選后體外培養(yǎng)有5位患者CD5+CD19細胞抑制HBV-specific-CTL細胞及非特異性CD8+細胞的功能。結(jié)論：HBV慢性感染患者CD5+CD19+細胞可能會影響特異性及非特異性CD8細胞的功能。第三部分 慢乙肝不同疾病進程中血小板減少的免疫機制研究背景及目的：血小板減少是慢乙肝肝硬化患者常見的并發(fā)癥,但是在慢乙肝無肝硬化階段也有部分患者發(fā)生血小板減少。在第一部分研究表明即使血小板數(shù)目未發(fā)生明顯減少的患者,血小板動力指標已經(jīng)出現(xiàn)異常,這用傳統(tǒng)的觀點無法解釋的。研究表明,慢乙肝及肝硬化患者未發(fā)生血小板減少時已有血小板動力的異常,伴或不伴血小板減少的慢乙肝患者均有免疫的異常,基于第二部分研究,本部分進一步明確細胞免疫及CD5+CD19+細胞是否參與HBV慢性感染患者血小板減少的機制。材料和方法：本研究共納入88名研究對象：包括25名慢乙肝患者,25名代償期肝硬化患者(其中12名Child A無小板減少的患者,13名Child A伴血小板減少的患者),及18名Child B/C患者,以及20名健康對照者。采用ELISA方法檢測血漿IL-10及IFN-γ水平,采用流式細胞計數(shù)檢測CD5+CD19+細胞表達。采用非特異性刺激后細胞培養(yǎng)胞內(nèi)染色的方法檢測IL-10+CD5+CD19+細胞表達。HBV-specific-CTL細胞的檢測采用Pro5(?)MHC Pentamer (A*02:01/FLPSDFFPSV Pro5(?)MHC Pentamer staining of HBV core 18-27-specific T cells)方法。結(jié)果：血小板數(shù)量與IFN-γ+CD8+細胞比例在慢乙肝組呈現(xiàn)負相關(r=-0.51,p=0.01)。慢乙肝組和肝硬化各組血小板數(shù)量均與CD107a+CD8+細胞比例呈負相關(CHB r=-0.57, p = 0.03; LC r=-0.50,p= 0.03)。CHB組及肝硬化組的CD5+CD19+細胞百分比均高于健康對照組。肝硬化組CD5+CD19+細胞百分比與血小板數(shù)目呈負性相關。肝硬化組體外細胞培養(yǎng)上清液中IL-10水平較其余各組明顯降低,但是其胞內(nèi)IL-10平均熒光強度(Mean fluorescence intensity, MFI)最高。結(jié)論：HBV慢性感染患者血小板減少機制涉及多方面因素,HBV非特異性CTL細胞可能對血小板有直接的作用,并且可能參與早期血小板動力指標的變化。Breg細胞的功能在肝硬化失代償期出現(xiàn)明顯異常,并且可能會參與血小板減少機制。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 Yao Zhang;Hua Zhang;Au Elizabeth;Xiao-qing Liu;;Epidemiology of Hepatitis B and Associated Liver Diseases in China[J];Chinese Medical Sciences Journal;2012年04期

本文編號：2750397