【摘要】：隨著科技進步、醫(yī)學發(fā)展及現(xiàn)代生活方式的改變,臨床上由條件致病真菌引起的感染愈發(fā)嚴重,其中,白色念珠菌(Candida albicans)最為常見。臨床抗真菌藥物的缺乏以及耐藥菌株的迅速出現(xiàn)和傳播,增加了真菌感染治療的難度。因此深入開展白色念珠菌致病機制的研究對臨床上白色念珠菌感染的預防、診斷、治療及預后意義重大。白色念珠菌引起感染的主要原因是其毒力因子的存在。與傳統(tǒng)藥物相比,靶向毒力不會威脅白色念珠菌的生存,大大降低了其耐藥的發(fā)生機率,因此近年來在尋找新的抗真菌策略過程中科學家們著眼于將真菌毒力作為藥物作用的新靶點。酵母態(tài)向菌絲態(tài)的形態(tài)轉化是白色念珠菌重要的毒力因子。在白色念珠菌侵入組織的過程中,酵母態(tài)有利于繁殖和傳播,菌絲態(tài)有利于黏附和侵襲,二者頻繁轉化,促進白色念珠菌的定植和感染。因此抑制白色念珠菌形態(tài)轉化可以阻止其向致病形態(tài)轉變,進而降低其感染能力,可作為一種有效的抗真菌策略。據(jù)文獻報道,在體外實驗中,白色念珠菌轉錄因子Flo8的缺失阻斷了菌絲的形成和菌絲特異性基因的表達,并且FLO8基因缺失菌株在小鼠系統(tǒng)性念珠菌感染模型中是無毒性的。因此,為了尋找與形態(tài)轉化有關的潛在的藥物靶點,本課題選取Flo8作為研究對象,采用化學分析的方法對比Flo8敲除菌株與其回補株在多種重要合成通路上化學成分含量差異,來研究轉錄因子Flo8是如何調節(jié)白色念珠菌菌絲形成的。利用高效液相色譜法(HPLC)分析菌株胞內及胞外(培養(yǎng)基)提取物化學成分的差異,我們發(fā)現(xiàn)flo8△/△菌株菌體粗提物中甲硫腺苷(MTA)含量明顯升高。氣相色譜質譜聯(lián)用(GC-MS)分析結果顯示,flo8△/△菌株法尼醇含量均是野生株SC5314的2倍左右,flo8△/△菌株法尼醇胞外分泌增多。98%以上的甲硫腺苷(MTA)是通過多胺合成途徑產生的,MTA可通過蛋氨酸補救途徑轉換為S-腺苷甲硫氨酸(SAM),參與多胺的生物合成。在白色念珠菌中,多胺合成途徑與菌絲的生長、毒力及耐藥性密切相關。在白色念珠菌中,多胺能夠誘導其向菌絲態(tài)轉化,抑制多胺的合成則會抑制菌絲的形成。因此,本課題采用外標法分析了多胺合成通路上相關成分的含量。在探索了不同提取和檢測方法后,最終采用高氯酸超聲萃取法提取白色念珠菌中的甲硫腺苷(MTA)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM),并采用HPLC-DAD方法檢測其含量;采用芴甲氧羰酰氯(FMOC-C1)柱前衍生化結合HPLC-FLD的方法檢測,腐胺(PUT)、亞精胺(SPD)、精胺(SPM)的含量。結果發(fā)現(xiàn),在FLO8敲除菌株中,MTA及PUT含量升高,SPD、SPM含量下降,多胺水平下降,表明基因敲除菌株中多胺合成通路被抑制。甾醇作為細胞膜脂質的重要組成成分,也與白色念珠菌的形態(tài)轉化密切相關,抑制甾醇合成通路,能夠抑制白色念珠菌菌絲形成能力。文獻報道,抑制白色念珠菌ERG11表達,會導致菌絲形成能力缺陷。本課題采用內標法分析了FLO8敲除菌株及其回補菌株在甾醇合成通路上相關成分的含量差異。采用GC-MS聯(lián)用的方法分析了酵母甾醇(Zymosterol)、糞甾醇(Fecosterol)、麥角甾醇(Ergosterol)、羊毛甾醇(Lanosterol)、4,4-二甲基酵母甾醇(4,4-dimethylzymosterol)。結果發(fā)現(xiàn)在甾醇合成通路中,敲除菌株中甾醇中間體Zymosterol、Fecosterol、Lanosterol、4,4-dimethylsterol含量升高,Ergosterol含量幾乎沒有變化,甾醇中間體的大量累積使Ergosterol在細胞膜中比例下降,菌絲形成受到抑制。另外,敲除株麥角甾醇合成通路中法尼醇含量增加,抑制了Cdc35的活性,從而使cAMP合成受阻,表明Flo8可通過調控甾醇合成通路影響cAMP-PKA通路,影響菌絲形成能力。另外,有趣的是,在甾醇合成通路中,由Zymosterol向Fecosterol轉化需要SAM參與,因此多胺合成通路與甾醇合成通路能夠通過共同的底物SAM聯(lián)系在一起,共同調控菌絲的形成。由于多胺合成通路和甾醇合成通路各成分含量發(fā)生了變化,本課題進一步采用實時熒光定量PCR(qPCR)的方法檢測了 FLO8基因敲除菌株與回補菌株在多胺合成通路和甾醇合成通路上相關基因的表達量,從基因水平上驗證這些化學成分的變化。結果發(fā)現(xiàn)在多胺合成通路中,催化鳥氨酸脫羧形成PUT的鳥氨酸脫羧酶編碼基因SPE1、SAM脫羧酶編碼基因SPE2、催化SPM氧化成SPD的多胺氧化酶編碼基因FMS1表達量上調,MTA磷酸化酶MEU1表達量下調,而SPD合成酶編碼基因SPE3和SPM合成酶編碼基因SPE4受負反饋調節(jié)表達上調,與含量檢測結果是一致的。甾醇合成通路中編碼甾醇C-24甲基轉移酶的基因ERG6表達量上調。此外,編碼法尼醇合成酶的基因DPP3表達量上調。以上結果表明,FLO8基因敲除菌株菌絲形成能力的降低與多胺合成通路被抑制,甾甾醇合成通路中間體積累、麥角甾醇相對含量下降有關。綜上所述,FLO8基因敲除的白色念珠菌表現(xiàn)為酵母態(tài),主要是通過以下三個方面來降低毒力的:(1)FLO8基因敲除,使得多胺合成通路受阻,多胺整體水平下降,抑制了酵母態(tài)向菌絲態(tài)轉化,毒力降低;(2)FLO8基因敲除,甾醇中間體累積,麥角甾醇比例下降,菌絲形成能力減弱,毒力下降;(3)FLO8基因敲除,DPP3表達量增加,法尼醇合成增加,通過抑制Ras1-cAMP-Efg1信號通路,抑制菌絲形成,使毒力下降。多胺合成通路、甾醇合成通路以及cAMP-PKA信號通路,這三種通路構成了一個調控網(wǎng)絡,轉錄因子Flo8正是通過這個復雜的、彼此聯(lián)系又相互制約的網(wǎng)絡來調控白色念珠菌菌絲形成。本論文著眼于靶向毒力的抗真菌新策略,采用化學分析方法分析了相關通路上的化學成分變化,研究了轉錄因子Flo8缺失使白色念珠菌毒力下降的原因。該研究提供了一個抗真菌毒力的新思路,即通過干預化學成分的合成來抑制菌絲形成能力,降低毒力,為研究靶向毒力提供了理論基礎。由化學成分變化結合調控它們的基因變化共同研究菌絲調控機制,提供了一個通過化學分析方法來研究并解決生物學相關問題的新方法。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R519.3

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本文編號：2748993