【摘要】：隨著科技進(jìn)步、醫(yī)學(xué)發(fā)展及現(xiàn)代生活方式的改變,臨床上由條件致病真菌引起的感染愈發(fā)嚴(yán)重,其中,白色念珠菌(Candida albicans)最為常見(jiàn)。臨床抗真菌藥物的缺乏以及耐藥菌株的迅速出現(xiàn)和傳播,增加了真菌感染治療的難度。因此深入開(kāi)展白色念珠菌致病機(jī)制的研究對(duì)臨床上白色念珠菌感染的預(yù)防、診斷、治療及預(yù)后意義重大。白色念珠菌引起感染的主要原因是其毒力因子的存在。與傳統(tǒng)藥物相比,靶向毒力不會(huì)威脅白色念珠菌的生存,大大降低了其耐藥的發(fā)生機(jī)率,因此近年來(lái)在尋找新的抗真菌策略過(guò)程中科學(xué)家們著眼于將真菌毒力作為藥物作用的新靶點(diǎn)。酵母態(tài)向菌絲態(tài)的形態(tài)轉(zhuǎn)化是白色念珠菌重要的毒力因子。在白色念珠菌侵入組織的過(guò)程中,酵母態(tài)有利于繁殖和傳播,菌絲態(tài)有利于黏附和侵襲,二者頻繁轉(zhuǎn)化,促進(jìn)白色念珠菌的定植和感染。因此抑制白色念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化可以阻止其向致病形態(tài)轉(zhuǎn)變,進(jìn)而降低其感染能力,可作為一種有效的抗真菌策略。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在體外實(shí)驗(yàn)中,白色念珠菌轉(zhuǎn)錄因子Flo8的缺失阻斷了菌絲的形成和菌絲特異性基因的表達(dá),并且FLO8基因缺失菌株在小鼠系統(tǒng)性念珠菌感染模型中是無(wú)毒性的。因此,為了尋找與形態(tài)轉(zhuǎn)化有關(guān)的潛在的藥物靶點(diǎn),本課題選取Flo8作為研究對(duì)象,采用化學(xué)分析的方法對(duì)比Flo8敲除菌株與其回補(bǔ)株在多種重要合成通路上化學(xué)成分含量差異,來(lái)研究轉(zhuǎn)錄因子Flo8是如何調(diào)節(jié)白色念珠菌菌絲形成的。利用高效液相色譜法(HPLC)分析菌株胞內(nèi)及胞外(培養(yǎng)基)提取物化學(xué)成分的差異,我們發(fā)現(xiàn)flo8△/△菌株菌體粗提物中甲硫腺苷(MTA)含量明顯升高。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析結(jié)果顯示,flo8△/△菌株法尼醇含量均是野生株SC5314的2倍左右,flo8△/△菌株法尼醇胞外分泌增多。98%以上的甲硫腺苷(MTA)是通過(guò)多胺合成途徑產(chǎn)生的,MTA可通過(guò)蛋氨酸補(bǔ)救途徑轉(zhuǎn)換為S-腺苷甲硫氨酸(SAM),參與多胺的生物合成。在白色念珠菌中,多胺合成途徑與菌絲的生長(zhǎng)、毒力及耐藥性密切相關(guān)。在白色念珠菌中,多胺能夠誘導(dǎo)其向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化,抑制多胺的合成則會(huì)抑制菌絲的形成。因此,本課題采用外標(biāo)法分析了多胺合成通路上相關(guān)成分的含量。在探索了不同提取和檢測(cè)方法后,最終采用高氯酸超聲萃取法提取白色念珠菌中的甲硫腺苷(MTA)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM),并采用HPLC-DAD方法檢測(cè)其含量;采用芴甲氧羰酰氯(FMOC-C1)柱前衍生化結(jié)合HPLC-FLD的方法檢測(cè),腐胺(PUT)、亞精胺(SPD)、精胺(SPM)的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在FLO8敲除菌株中,MTA及PUT含量升高,SPD、SPM含量下降,多胺水平下降,表明基因敲除菌株中多胺合成通路被抑制。甾醇作為細(xì)胞膜脂質(zhì)的重要組成成分,也與白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化密切相關(guān),抑制甾醇合成通路,能夠抑制白色念珠菌菌絲形成能力。文獻(xiàn)報(bào)道,抑制白色念珠菌ERG11表達(dá),會(huì)導(dǎo)致菌絲形成能力缺陷。本課題采用內(nèi)標(biāo)法分析了FLO8敲除菌株及其回補(bǔ)菌株在甾醇合成通路上相關(guān)成分的含量差異。采用GC-MS聯(lián)用的方法分析了酵母甾醇(Zymosterol)、糞甾醇(Fecosterol)、麥角甾醇(Ergosterol)、羊毛甾醇(Lanosterol)、4,4-二甲基酵母甾醇(4,4-dimethylzymosterol)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在甾醇合成通路中,敲除菌株中甾醇中間體Zymosterol、Fecosterol、Lanosterol、4,4-dimethylsterol含量升高,Ergosterol含量幾乎沒(méi)有變化,甾醇中間體的大量累積使Ergosterol在細(xì)胞膜中比例下降,菌絲形成受到抑制。另外,敲除株麥角甾醇合成通路中法尼醇含量增加,抑制了Cdc35的活性,從而使cAMP合成受阻,表明Flo8可通過(guò)調(diào)控甾醇合成通路影響cAMP-PKA通路,影響菌絲形成能力。另外,有趣的是,在甾醇合成通路中,由Zymosterol向Fecosterol轉(zhuǎn)化需要SAM參與,因此多胺合成通路與甾醇合成通路能夠通過(guò)共同的底物SAM聯(lián)系在一起,共同調(diào)控菌絲的形成。由于多胺合成通路和甾醇合成通路各成分含量發(fā)生了變化,本課題進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)的方法檢測(cè)了 FLO8基因敲除菌株與回補(bǔ)菌株在多胺合成通路和甾醇合成通路上相關(guān)基因的表達(dá)量,從基因水平上驗(yàn)證這些化學(xué)成分的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多胺合成通路中,催化鳥(niǎo)氨酸脫羧形成PUT的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶編碼基因SPE1、SAM脫羧酶編碼基因SPE2、催化SPM氧化成SPD的多胺氧化酶編碼基因FMS1表達(dá)量上調(diào),MTA磷酸化酶MEU1表達(dá)量下調(diào),而SPD合成酶編碼基因SPE3和SPM合成酶編碼基因SPE4受負(fù)反饋調(diào)節(jié)表達(dá)上調(diào),與含量檢測(cè)結(jié)果是一致的。甾醇合成通路中編碼甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶的基因ERG6表達(dá)量上調(diào)。此外,編碼法尼醇合成酶的基因DPP3表達(dá)量上調(diào)。以上結(jié)果表明,FLO8基因敲除菌株菌絲形成能力的降低與多胺合成通路被抑制,甾甾醇合成通路中間體積累、麥角甾醇相對(duì)含量下降有關(guān)。綜上所述,FLO8基因敲除的白色念珠菌表現(xiàn)為酵母態(tài),主要是通過(guò)以下三個(gè)方面來(lái)降低毒力的:(1)FLO8基因敲除,使得多胺合成通路受阻,多胺整體水平下降,抑制了酵母態(tài)向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化,毒力降低;(2)FLO8基因敲除,甾醇中間體累積,麥角甾醇比例下降,菌絲形成能力減弱,毒力下降;(3)FLO8基因敲除,DPP3表達(dá)量增加,法尼醇合成增加,通過(guò)抑制Ras1-cAMP-Efg1信號(hào)通路,抑制菌絲形成,使毒力下降。多胺合成通路、甾醇合成通路以及cAMP-PKA信號(hào)通路,這三種通路構(gòu)成了一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),轉(zhuǎn)錄因子Flo8正是通過(guò)這個(gè)復(fù)雜的、彼此聯(lián)系又相互制約的網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)控白色念珠菌菌絲形成。本論文著眼于靶向毒力的抗真菌新策略,采用化學(xué)分析方法分析了相關(guān)通路上的化學(xué)成分變化,研究了轉(zhuǎn)錄因子Flo8缺失使白色念珠菌毒力下降的原因。該研究提供了一個(gè)抗真菌毒力的新思路,即通過(guò)干預(yù)化學(xué)成分的合成來(lái)抑制菌絲形成能力,降低毒力,為研究靶向毒力提供了理論基礎(chǔ)。由化學(xué)成分變化結(jié)合調(diào)控它們的基因變化共同研究菌絲調(diào)控機(jī)制,提供了一個(gè)通過(guò)化學(xué)分析方法來(lái)研究并解決生物學(xué)相關(guān)問(wèn)題的新方法。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R519.3

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本文編號(hào)：2748993