【摘要】：目的建立馬爾尼菲青霉�。≒enicilliosis marneffei，PSM）快速、敏感、特異的實時熒光定量PCR （real time quantitative PCR，qPCR）方法，并對方法科學(xué)性進行評價。 方法從Genebank上下載馬爾尼菲青霉（Penicillium marneffei，PM）ITS（Internal Transcribed Spacer)區(qū)序列，使用Clustalx和BioEdit軟件進行比對，獲取PM最保守的區(qū)域序列。參考ABI Primer Express3.0軟件工作原理，手工設(shè)計實時熒光定量PCR引物和TaqMan探針，并使用BLAST等加以驗證。提取PM標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161基因組DNA，采用普通PCR的方法對其進行擴增特異性片段，擴增產(chǎn)物回收純化后與pEASY-T5Zero vector連接成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌），經(jīng)基因序列分析方法鑒定重組質(zhì)粒。培養(yǎng)大腸桿菌，提取重組質(zhì)粒，根據(jù)重組質(zhì)粒的光密度（OD）值計算出重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)，10倍梯度稀釋后作為實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)用設(shè)計的引物和探針初步建立實時熒光定量PCR檢測方法，探索最佳反應(yīng)體系。建立該反應(yīng)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在不同時間、不同儀器進行批內(nèi)、批間重復(fù)4次實驗，評價該體系的最低檢測限(limit of detection，LOD)、檢測下限、線性范圍、重復(fù)性等指標(biāo)。分別提取PM（5株臨床分離株）、健康人血清、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、煙曲霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉、米曲霉、黑曲霉、土曲霉、新生隱球菌、不規(guī)則根毛霉、卷曲毛霉、米根毛霉、尖端賽多孢子菌的基因組DNA，驗證其診斷特異性。收集PSM患者血清標(biāo)本，提取高質(zhì)量真菌DNA，以之為模板，通過qPCR手段檢測標(biāo)本中的真菌DNA載量，評價該診斷方法的科學(xué)性。 結(jié)果成功設(shè)計PM的特異性引物探針，擴增曲線呈典型“S”形。在最佳反應(yīng)體系下，5株臨床分離株P(guān)M基因組DNA的qPCR反應(yīng)體系能進行特異性擴增，而含健康人血清、侵襲性曲霉病患者血清、播散性隱球菌病患者血清和上述常見病原細(xì)菌、真菌的基因組DNA的體系均不能擴增。在10～1×107拷貝數(shù)之間的不同底物濃度與Cq值之間具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均在0.99以上，斜率在-3.3左右。反應(yīng)體系檢測的靈敏度為5～10拷貝數(shù)，所有反應(yīng)體系穩(wěn)定性、重復(fù)性好，批內(nèi)、批間重復(fù)4次實驗，所得每一種反應(yīng)體系Cq值批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均小于5%。所建立的反應(yīng)體系對臨床分離菌株檢測的結(jié)果陽性率為100%，并且無交叉反應(yīng)發(fā)生。55例PSM患者血清qPCR均陽性，Cq值在28.39～39.65之間。 結(jié)論成功設(shè)計了特異性檢測PM的引物、探針，并建立了實時熒光定量PCR檢測體系，臨床分離的5株P(guān)M全部檢出，與臨床其他常見的病原細(xì)菌、真菌及人基因組DNA無交叉反應(yīng)。實驗建立的qPCR檢測體系穩(wěn)定、可靠，有助于早期、特異地診斷PSM。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R756

【參考文獻】

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本文編號：2748473