發(fā)布時間：2020-07-01 10:08

【摘要】：目的:慢性乙型肝炎是全球關注的健康問題,泛素特異性蛋白酶18屬于干擾素刺激基因,本研究旨在探討USP18對Ⅰ型干擾素(IFNα)及Ⅲ型干擾素(IFNλ)抗HBV的影響及其相關機制。方法:將HepG2.2.15細胞隨機分為空白對照組、USP18過表達+IFNα組、空載+IFNα組、USP18過表達+IFNλ組、空載+IFNλ組�？瞻讓φ战M未經(jīng)任何處理,其余幾組采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染pEGFP-USP18,PEGFP-N1 質(zhì)粒 DNA 48 小時后,采用 Western blot 檢測USP18的相對表達量。其次,分別用IFNα及IFNλ對轉(zhuǎn)染48小時后的細胞進行24小時的藥物干預,采用Western blot,RT-qPCR檢測JAK/STAT信號通路和ISG15,MXA,IFIT1及HBcAg的表達情況;化學發(fā)光法檢測細胞上清中的HBeAg及HBsAg;PCR熒光探針法檢測細胞上清中的HBV-DNA表達情況。結果:首先,USP18蛋白相對表達量在USP18過表達組中最高,USP18成功過表達,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);其次,在IFNα處理組中,空載組中HBsAg,HBeAg及HBV-DNA的表達均低于USP18過表達組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而IFNλ處理組中,三者差異不大;并且,在IFNα干預組中,陽性對照組的抗病毒蛋白ISG15,MxA,IFIT1表達均高于USP18過表達組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而在IFNλ干預組中仍無太大差別;最后,JAK/STAT信號通路上的pSTAT1在IFNα干預組中,USP18過表達組明顯低于空載組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),反之,在IFNλ干預組中,試驗組與對照組仍無明顯差別。結論:USP18通過抑制JAK/STAT信號通路的激活,從而減少抗病毒蛋白的表達,最終降低了 IFNα抗HBV的活性及復制能力。相比之下,USP18對IFNλ通過JAK/STAT通路抗HBV無明顯抑制作用。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R512.62
【圖文】：

逑置熒光顯微鏡下，隨機�。保皞�高倍鏡視野觀察綠色熒光蛋白的表達，分別計算帶逡逑綠色熒光蛋白細胞數(shù)及細胞總數(shù)，兩者百分比計為轉(zhuǎn)染效率（圖１）。逡逑ｍｍ逡逑ｍｕ逡逑ｌｉｇｈｔ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（邋ｘ邋１邋Ｏ）邐ｆｌｕｏｒｏｓｃｏｐｅ邋（ｘ邋１０）逡逑圖１．空載和ＵＳＰ１８過表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染ＨｅｐＧ２．２．１５細胞４８小時后光鏡（ｘｌ0）和熒光鏡逡逑（ｘｌ0）下觀察細胞及熒光細胞，大概估算轉(zhuǎn)染效率。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ＨｅｐＧ２．２．１５邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｆｏｒ邋４８邋ｈ邋ｉｎ邋ｓｉｘ－ｗｅｌｌ邋ｐｌａｔｅｓ邋ｗｉｔｈ逡逑ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ邋ａｎｄ邋ｐＥＧＦＰ－ＵＳＰ１８．ＧＦＰ．邋ＧＦＰ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｗａｓ邋ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｕｎｄｅｒ邋ｌｉｇｈｔ邋ａｎｄ逡逑ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋（ｘｌ0）＃逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ測量各組ＵＳＰ１８蛋白相對表達量。結果顯示轉(zhuǎn)染ｐＥＧＦＰ－ＵＳＰ１８逡逑組的ＵＳＰ１８蛋白表達量明顯高于ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ轉(zhuǎn)染組和空白對照組，ＵＳＰ１８成功過逡逑表達（圖２Ａ）。進一步通過ＲＴ－ｑＰＣＲ檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞４８小時后，再分別經(jīng)ＩＦＮａ逡逑（１００ＩＵ／ｍｌ）和邋ＩＦＮＸ邋（５０ｎｇ／ｍｌ）處理邋２４邋小時的細胞邋ＲＮＡ，ｐＥＧＦＰ－ＵＳＰ１８邋組明顯逡逑高于ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ組和陰性對照組（ｐ＜０．０５，圖２Ｂ）。ＵＳＰ１８過表達細胞模型成功構逡逑建，可繼續(xù)用于后續(xù)實驗。逡逑２０逡逑

Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ測量各組ＵＳＰ１８蛋白相對表達量。結果顯示轉(zhuǎn)染ｐＥＧＦＰ－ＵＳＰ１８逡逑組的ＵＳＰ１８蛋白表達量明顯高于ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ轉(zhuǎn)染組和空白對照組，ＵＳＰ１８成功過逡逑表達（圖２Ａ）。進一步通過ＲＴ－ｑＰＣＲ檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞４８小時后，再分別經(jīng)ＩＦＮａ逡逑（１００ＩＵ／ｍｌ）和邋ＩＦＮＸ邋（５０ｎｇ／ｍｌ）處理邋２４邋小時的細胞邋ＲＮＡ，ｐＥＧＦＰ－ＵＳＰ１８邋組明顯逡逑高于ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ組和陰性對照組（ｐ＜０．０５，圖２Ｂ）。ＵＳＰ１８過表達細胞模型成功構逡逑建，可繼續(xù)用于后續(xù)實驗。逡逑２０逡逑

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