【摘要】：背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)屬于嗜肝DNA病毒科,為部分雙鏈環(huán)狀DNA。乙型肝炎病毒的感染是一個(gè)全球公共衛(wèi)生問題,目前有20億人口感染HBV,其中2.4億人為慢性感染者。乙型肝炎病毒感染機(jī)體后,可引起肝炎、肝纖維化甚至是肝癌�，F(xiàn)有的干擾素類藥物和核苷類似物無法完全清除乙型肝炎病毒DNA,因此,根治HBV仍然是臨床醫(yī)生面臨的一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)。法尼酯X受體(Farnesoid X receptor,FXR)是膽汁酸受體,屬于核受體超家族中的一員,法尼酯X受體FXR在膽汁酸、膽固醇、甘油三酯及葡萄糖代謝方面扮演著重要角色。HBV感染可導(dǎo)致體內(nèi)膽汁酸水平升高,但膽汁酸及膽汁酸受體FXR在HBV感染中的病理生理作用仍不清楚。目的探討膽汁酸及膽汁酸受體FXR在乙型肝炎病毒感染中的作用機(jī)制,從而為乙型肝炎病毒感染的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法(1)收集HBV感染者肝臟組織標(biāo)本及相關(guān)臨床資料,HE染色和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測肝臟HBsAg、HBcAg及CYP7A1的表達(dá),分析HBV感染者膽汁酸與肝臟病理變化之間的關(guān)系;(2)在HepG2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染pAAV/HBV1.2質(zhì)粒,pFXR質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染后24小時(shí)加CDCA及FXR拮抗劑Z-Guggulsterone處理24小時(shí),收集胞內(nèi)蛋白及細(xì)胞上清液,ELISA檢測HBsAg和HBeAg表達(dá);(3)在HepG2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染pGL3-SP1或pGL3-SP2、pFXR質(zhì)粒,同時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加CDCA,48小時(shí)后檢測熒光素酶活性;(4)在HepG2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染pAAV/HBV1.2質(zhì)�；騪AAV/HBV1.2 HBeAg-null質(zhì)粒,pFXR質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加CDCA刺激48小時(shí),提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,RT-PCR檢測相關(guān)分子表達(dá);(5)選取6-8周齡SPF級的C57BL/6及FXR~(-/-)雄性小鼠,每只小鼠高壓尾靜脈注射10μg pAAV/HBV1.2質(zhì)粒,構(gòu)建HBV小鼠模型,不同時(shí)間點(diǎn)采集小鼠血清標(biāo)本,ELISA檢測HBV小鼠血清HBsAg、HBeAg、HBcAb、IL-10水平;提取HBV小鼠血清病毒DNA,RT-PCR技術(shù)檢測血清病毒DNA含量;提取HBV小鼠肝臟蛋白,ELISA檢測HBV小鼠肝臟中HBsAg、HBeAg表達(dá)情況;免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測HBV小鼠肝臟內(nèi)HBcAg表達(dá)情況;HBV小鼠肝臟組織經(jīng)超聲破碎勻漿后提取總RNA,RT-PCR技術(shù)檢測肝臟固有免疫分子等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化;HBV小鼠肝臟經(jīng)一系列方式處理后做HE染色,從形態(tài)學(xué)方面來觀察小鼠肝臟損傷程度;取HBV小鼠血清檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT活性變化;(6)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(t-test)統(tǒng)計(jì)分析,使用Graph Pad Prism5.0軟件作圖,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(1)收集臨床HBV感染者的肝臟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以檢測其肝臟中HBsAg及CYP7A1的表達(dá),對HBsAg及CYP7A1的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行0-5分評分,根據(jù)HBV感染者肝臟HBsAg免疫組織化學(xué)結(jié)果評分及血清總膽汁酸水平做相關(guān)曲線分析,結(jié)果顯示:HBV感染者肝臟內(nèi)HBsAg的表達(dá)與血清總膽汁酸水平呈正相關(guān),且HBsAg與CYP7A1也呈正相關(guān);HBV感染患者引起的肝臟毛玻璃樣病變與膽汁酸有關(guān);(2)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pAAV/HBV1.2和pFXR質(zhì)粒24小時(shí)后,加入CDCA及FXR拮抗劑Z-Guggulsterone作用24小時(shí),ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FXR拮抗劑Z-Guggulsterone可以抑制HBsAg及HBeAg的表達(dá)(P0.05);(3)在HepG2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染pGL3-SP1或pGL3-SP2、pFXR質(zhì)粒,同時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加CDCA,48小時(shí)后檢測熒光素酶活性,結(jié)果顯示:CDCA通過FXR使pre-S1啟動子的活性升高1.7倍,CDCA通過FXR使pre-S2啟動子的活性升高1.4倍(P0.05);(4)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pAAV/HBV1.2和pFXR質(zhì)粒24小時(shí)后,加入CDCA刺激48小時(shí),RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FXR+CDCA組固有免疫分子TLR2的表達(dá)下降,同時(shí)伴有TNFα表達(dá)下降和ATF6上升(P0.05);胞內(nèi)和細(xì)胞上清中病毒DNA的RT-PCR檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染pFXR并且加CDCA處理后,細(xì)胞上清中的病毒DNA含量下降,而胞內(nèi)病毒DNA含量上升(P0.05)。HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pAAV/HBV1.2 HBeAg-null和pFXR質(zhì)粒24小時(shí)后,加入CDCA刺激48小時(shí),RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:FXR+CDCA組固有免疫分子TLR2表達(dá)不再下調(diào),TNFα表達(dá)下降,ATF6表達(dá)上升;(5)與C57BL/6小鼠相比,ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FXR~(-/-)模型鼠的血清及肝臟中HBsAg、HBeAg的表達(dá)下降;免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示FXR~(-/-)模型鼠肝臟中HBcAg的表達(dá)下降;ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FXR~(-/-)模型鼠血清中的HBcAb水平下降,然而尾靜脈高壓注射后的C57BL/6小鼠及FXR~(-/-)小鼠血清中的細(xì)胞因子IL-10無差異;RT-PCR檢測小鼠肝臟中固有免疫分子及相關(guān)炎癥分子的結(jié)果表明:FXR~(-/-)模型鼠肝臟中固有免疫分子TLR2表達(dá)升高,TNFα和IFNγ的表達(dá)均下降;同時(shí)尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒后的FXR~(-/-)小鼠血清病毒DNA的含量低于C57BL/6小鼠血清病毒DNA含量;HE染色結(jié)果提示:C57BL/6小鼠與FXR~(-/-)小鼠肝組織在形態(tài)學(xué)方面無顯著差異;血清轉(zhuǎn)氨酶結(jié)果顯示:正常的C57BL/6小鼠和FXR~(-/-)小鼠血清中的ALT無差異,而尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒后第1天,C57BL/6小鼠與FXR~(-/-)小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶急劇升高,但在尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒后第7天,C57BL/6小鼠與FXR~(-/-)小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶基本恢復(fù)正常。結(jié)論(1)在HBV感染FXR~(-/-)小鼠模型,HBsAg、HBeAg及HBcAg表達(dá)下降;(2)膽汁酸通過FXR促進(jìn)HBeAg的表達(dá),從而抑制固有免疫分子TLR2;(3)膽汁酸通過FXR促進(jìn)HBV復(fù)制,但抑制HBV病毒粒子的釋放;(4)HBV感染患者引起的肝臟毛玻璃樣病變與膽汁酸有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R512.62
【圖文】：

圖 3-1 肝臟毛玻璃樣變性與肝內(nèi) HBsAg 有關(guān)注：圖 3-1 是 HBV 感染者肝臟 HE 染色及 HBsAg 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，圖 a、均為放大 200 倍。 HBV 感染者肝臟中 HBsAg 與血清總膽汁酸含量關(guān)系醫(yī)院收集的 HBV 患者肝臟石蠟切片（N=12）行免疫組織化學(xué) HBsAg免疫組織化學(xué) HBsAg 染色結(jié)果進(jìn)行 0-5 分評分。對 HBV 患者的免疫組分和血清總膽汁酸含量做相關(guān)曲線，如圖 3-2，結(jié)果顯示：HBV 患者血清總膽汁酸含量呈正相關(guān)，P = 0.0012，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

26圖 3-2 HBV 感染者肝內(nèi) HBsAg 與血清總膽汁酸含量呈正相關(guān)注：圖 3-2 是對 HBV 感染者肝臟 IHC-HBsAg 評分和血清總膽汁酸含量做相關(guān)曲線的結(jié)果。3.3 HBV 感染者肝臟中 HBsAg 與肝內(nèi) CYP7A1 呈正相關(guān)對從醫(yī)院收集的HBV患者肝臟石蠟切片（N=12）行免疫組織化學(xué)HBsAg和CYP7A1染色，在鏡下對免疫組織化學(xué) HBsAg 和 CYP7A1 染色結(jié)果進(jìn)行 0-5 分評分，分析 HBV感染者肝內(nèi) HBsAg 與肝內(nèi) CYP7A1 的關(guān)系，結(jié)果顯示：HBV 感染者肝臟 HBsAg 和CYP7A1 呈正相關(guān)。圖 3-3 HBV 感染者肝臟中 HBsAg 與肝內(nèi) CYP7A1 呈正相關(guān)注：圖 3-3 是 HBV 感染者肝臟 HBsAg、CYP7A1 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，圖 a、b、c、d 均為放大 200 倍。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 田景惠;趙躍然;;HBV受體Na~+-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)研究新進(jìn)展[J];中國病原生物學(xué)雜志;2015年07期

2 Motoko Ohno;Motoyuki Otsuka;Takahiro Kishikawa;Takeshi Yoshikawa;Akemi Takata;Kazuhiko Koike;;Novel therapeutic approaches for hepatitis B virus covalently closed circular DNA[J];World Journal of Gastroenterology;2015年23期

3 曹政媛;;260例乙型肝炎患者血清總膽汁酸檢測分析[J];檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床;2011年03期

4 張孟瑜;李波;夏先明;;核受體FXR與膽汁酸代謝及相關(guān)疾病的關(guān)系[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2010年24期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王昊亮;膽汁酸升高的慢性乙型肝炎患者T細(xì)胞免疫衰老及肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)升高[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

本文編號：2734586