【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)慢性感染具有發(fā)病率高、致病性強(qiáng)和發(fā)病機(jī)制不明確等特點(diǎn)。我們先前的研究提示磷脂代謝通路在HBV的復(fù)制中有重要作用。然而HBV復(fù)制與磷脂代謝物之間究竟有何關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。磷脂是組成生物膜的主要成分,還參與信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程,其生物功能越來(lái)越被大眾所認(rèn)知。磷脂結(jié)構(gòu)具有高度復(fù)雜性和多樣性,而且生物樣品中某些重要的磷脂含量非常低。因此,很有必要開(kāi)發(fā)一個(gè)具有高通量、高靈敏度且應(yīng)用廣泛的磷脂定量分析方法。本論文以感染HBV的患者血清和細(xì)胞模型為研究對(duì)象,旨在開(kāi)發(fā)一種基于色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的磷脂定性與定量分析方法,并用此方法研究HBV感染后宿主磷脂代謝物水平的變化,再結(jié)合分子生物學(xué)研究技術(shù)綜合研究HBV復(fù)制與宿主磷脂代謝之間的關(guān)系。本論文開(kāi)發(fā)了一種基于超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(Ultrahigh-performance liquid chromatography system coupled to a triple-quadrupole mass spectrometer,UHPLC-MS)的磷脂分析方法,在10分鐘內(nèi)對(duì)生物樣品中主要的10類(lèi)磷脂進(jìn)行定量分析。這10類(lèi)磷脂包括磷脂酸(Phosphatidic acid,PA)、磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine,PE)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol,PG)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)、鞘磷脂(Sphingomyelin,SM)、溶血磷脂酸(Lyso-phosphatidic acid,LPA)、溶血磷脂酰膽堿(Lyso-phosphatidylcholine,LPC)和溶血磷脂酰乙醇胺(Lyso-phosphatidylethanolamine,LPE)。我們開(kāi)發(fā)的磷脂分析方法的檢測(cè)限(Limit of detection,LOD)和定量限(Limit of quantitation,LOQ)分別為 0.04-33 pmol/mL 和 0.1-110 pmol/mL。而磷脂定性與定量分析通過(guò)三步實(shí)現(xiàn),第一步和第二步分別在正離子模式和負(fù)離子模式下結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式、Product ion scan模式以及色譜峰的保留時(shí)間,盡可能在混合樣品中鑒定更多的磷脂分子結(jié)構(gòu)。從而為第三步生物樣品定量分析提供有效的磷脂代謝物信息。我們還利用相對(duì)響應(yīng)值對(duì)不同�；滈L(zhǎng)度的MS響應(yīng)差異進(jìn)行定量校正,從而實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的定量。將本研究方法應(yīng)用于6類(lèi)不同的生物樣品(人血漿、大鼠血漿、A549細(xì)胞、16HBE細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和大鼠肝臟)的磷脂分析進(jìn)行適用性驗(yàn)證,最終在這6類(lèi)生物樣品中共鑒定10類(lèi)磷脂308種磷脂分子結(jié)構(gòu),定量295種磷脂分子。因此,我們開(kāi)發(fā)的UHPLC-MS磷脂分析方法具有高效率(尤其適用于大樣本分析)、高靈敏度、高通量和廣泛適用性。為了闡明HBV感染和復(fù)制與宿主磷脂代謝物之間的關(guān)系,我們分別分析了感染HBV的患者血清和細(xì)胞中的10類(lèi)主要的磷脂代謝物水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與HBsAg陰性(-)患者相比,HBsAg陽(yáng)性(+)患者的PC、PE和LPA的含量升高,而PS、PG、PI和SM的含量降低。此外,我們?cè)诟腥綡BV并能穩(wěn)定遺傳HBV的細(xì)胞模型HepG2.2.15細(xì)胞中也證實(shí)了HBV感染和復(fù)制導(dǎo)致宿主的PC上調(diào),PS、PG和PI下調(diào)。受試者特征工作曲線(Receiver operating characteristic,ROC)分析顯示與其他磷脂相比,PC的水平變化能夠更好的預(yù)測(cè)HBV感染,這提示PC可能是HBV感染潛在的生物標(biāo)志物。然后我們進(jìn)一步評(píng)估PC的合成與代謝通路中重要酶的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV感染后的細(xì)胞PC合成的關(guān)鍵酶PCYT1A和LPP1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)。當(dāng)我們通過(guò)轉(zhuǎn)染小干擾 RNA(Small interference RNA,siRNA)進(jìn)入 HepG2.2.15細(xì)胞中下調(diào)磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶(Choline-phosphate cytidylyltransferase 1 A,PCYT1A)和磷脂酸磷脂酶(Lipid phosphate phosphatase 1,LPP1)的表達(dá)后,HBV的復(fù)制受到抑制。這些結(jié)果表明,HBV感染后細(xì)胞宿主的PC合成受到PCYT1A和LPP1活性的調(diào)控,提示PCYT1 A和LPP1可能成為HBV治療的新的潛在的靶點(diǎn)。此研究為HBV感染和復(fù)制的發(fā)病機(jī)制提供了新的信息,為治療HBV感染和復(fù)制提供潛在的新線索。綜上所述,本文開(kāi)發(fā)了一種基于UHPLC-MS的高效率、高靈敏度、高通量和廣泛適用于大樣本生物樣本分析的磷脂定量分析方法。然后結(jié)合UHPLC-MS磷脂定量分析方法和分子生物技術(shù)研究HBV感染和復(fù)制與宿主磷脂代謝的關(guān)系,為研究HBV感染的致病機(jī)制和治療提供了新的線索。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62;O657.63
【圖文】：

含ＨＢｓＡｇ），因其不含病毒ＤＮＡ而不具感染性。管形顆粒由ＨＢｓＡｇ組成，無(wú)逡逑感染性。ＨＢＶ的基因組為單拷貝的不完整雙鏈ＤＮＡ，由長(zhǎng)度不等的正負(fù)兩條鏈逡逑構(gòu)成（圖１．１）。長(zhǎng)鏈為負(fù)鏈，長(zhǎng)度恒定，由約３２００個(gè)核苷酸構(gòu)成，擁有完整的、逡逑貫穿整個(gè)基因組序列的結(jié)構(gòu)。短鏈為正鏈，長(zhǎng)度可變化，約為長(zhǎng)鏈的５０％？８０％，逡逑其延伸只覆蓋了大約三分之二的病毒基因組長(zhǎng)度。ＨＢＶＤＮＡ的長(zhǎng)鏈含有四個(gè)開(kāi)逡逑放閱讀框，分別是Ｓ區(qū)、Ｃ區(qū)、Ｐ區(qū)和Ｘ區(qū)，編碼ＨＢＶ的全部己知蛋白。逡逑Ｓ區(qū)又分為前Ｓ１、前Ｓ２及Ｓ三個(gè)編碼區(qū)，分別編碼ＰｒｅＳｌ、ＰｒｅＳ２及ＨＢｓＡｇ逡逑蛋白，三者共同構(gòu)成ＨＢＶ的包膜蛋白。Ｃ區(qū)由前Ｃ基因和Ｃ基因組成，分別逡逑編碼（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｅａｎｔｉｇｅｎ，ＨＢｅＡｇ）和（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｃｏｒｅａｎｔｉｇｅｎ，ＨＢｃＡｇ）蛋白，逡逑其中ＨＢｃＡｇ是ＨＢＶ核衣殼的重要組成部分，而ＨＢｅＡｇ既不是病毒的結(jié)構(gòu)逡逑蛋白，也不是病毒復(fù)制所必需，主要分泌到宿主細(xì)胞外。Ｐ區(qū)編碼多種功能蛋白，逡逑包括具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的ＤＮＡ聚合酶、ＲＮＡ酶等

／邐＼邐０．７邋ｋｂ邋Ｘ邋ｍＲＮＡ逡逑ＢＣＰ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋Ｅｎｈａｎｃｅｒ邋ＩＩ逡逑圖１．１邋ＨＢＶ基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白［５］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｄｉｎｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｆ邋ＨＢＶ逡逑２０１５年，世界衛(wèi)生組織（Ｗｏｒｌｄ邋ｈｅａｌｔｈ邋ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＷＨＯ）報(bào)道全球約有逡逑２．５７億（相當(dāng)于總?cè)丝诘模常担ィ┞裕龋拢指腥菊撸郏叮�，且２０１５年的總死亡人逡逑�?shù)中約有８８．７萬(wàn)是死于ＨＢＶ感染Ａ邋ＨＢＶ感染的自然過(guò)程復(fù)雜、多變，臨逡逑床上ＨＢＶ感染引起的疾病包括急性肝炎、慢性乙型肝炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ邋ｈｅｐａｔｉｔｉｓ邋Ｂ，逡逑ＣＨＢ）、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）等［５，８］。長(zhǎng)期的逡逑ＨＢＶ感染可以引起脂肪肝、肝纖維化，嚴(yán)重的可發(fā)展為ＨＣＣ［５，８］。研究表明，逡逑ＨＣＣ與ＨＢＶ感染密切相關(guān)ｔ９＿１１］，全球有超過(guò)５０％的ＨＣＣ患者與ＨＢＶ感逡逑染密切相關(guān)

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本文編號(hào)：2722508