【摘要】：云南位于中國(guó)西南邊陲,毗鄰世界著名毒品產(chǎn)地金三角地區(qū),是毒品進(jìn)入中國(guó)的重要通道,也是HIV-1進(jìn)入中國(guó)的門戶。我國(guó)現(xiàn)在流行的主要HIV-1毒株大都首先傳入云南或在云南形成,然后經(jīng)吸毒或性傳播人群傳入廣西、四川和新疆以及其他地區(qū),最終導(dǎo)致全國(guó)范圍的流行。因此,云南被認(rèn)為是我國(guó)HIV-1流行的中心,其HIV-1毒株流行的特征影響全國(guó)HIV-1毒株變異和進(jìn)化。大量研究顯示,云南HIV-1流行有明顯的地區(qū)和人群差異,且流行病毒株處于不斷地變化之中,迫切需要對(duì)該地區(qū)不斷進(jìn)行HIV-1流行的分子流行病學(xué)研究。在本研究中,我們以云南省艾滋病關(guān)愛中心2013-2015年收治的773例HIV-1感染者和艾滋病患者為研究對(duì)象,獲得其人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息,擴(kuò)增、測(cè)定其體內(nèi)HIV-1主要結(jié)構(gòu)基因序列,分析病毒亞型和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,推測(cè)病毒耐藥信息,檢測(cè)HCV協(xié)同感染狀況,針對(duì)特定研究對(duì)象擴(kuò)增測(cè)定近似全長(zhǎng)基因,全面系統(tǒng)地了解云南HIV-1毒株的變異和流行特征,為云南乃至全國(guó)的HIV-1防控提供基礎(chǔ)信息。目的:(1)了解云南省流行HIV-1毒株的亞型分布、表型特點(diǎn)及變異特征;(2)確定云南省HIV-1耐藥毒株的類型、分布和傳播狀況,為云南省艾滋病的抗病毒治療提供信息;(3)基于長(zhǎng)片段基因序列和近似全長(zhǎng)HIV-1基因序列,了解和掌握云南省HIV-1毒株的重組特點(diǎn)和各個(gè)基因的進(jìn)化特征;(4)分析云南省HIV-1感染者中HCV協(xié)同感染情況及HCV亞型分布情況。方法:以云南省艾滋病關(guān)愛中心2013年7月到2015年7月收治的所有(773例)HIV-1感染者為研究對(duì)象,收集背景信息,采集外周血樣本,測(cè)定CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)后分離血漿和淋巴細(xì)胞富集液,進(jìn)行以下研究:(1)提取病毒RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄巢式-PCR的方法擴(kuò)增、測(cè)定gag、pol、env及部分樣本3’半分子基因。序列經(jīng)拼接、校對(duì)后,提交在線HIV-1序列數(shù)據(jù)庫(kù),利用在線軟件進(jìn)行質(zhì)量控制。使用網(wǎng)絡(luò)分型軟件REGA、jp HMM、RIP、NCBI確定HIV-1亞型或重組基因型。(2)將獲得的序列與HIV-1各亞型標(biāo)準(zhǔn)參考序列比對(duì)后,利用Mega6.06軟件,選擇Kimura 2-parameter model模型,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,將系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果與分型軟件結(jié)果相互印證。應(yīng)用Phy ML3.0選擇GTR+I+G堿基替代模型構(gòu)建ML樹,進(jìn)一步確定流行簇,分析不同毒株系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。利用BEAST軟件中Markov Chains Monte Carlo進(jìn)化分析方法構(gòu)建MCC樹,分析重要毒株不同流行簇起源時(shí)間,預(yù)測(cè)有效感染人數(shù)。(3)使用geno2pheno、PSSM軟件,根據(jù)env區(qū)V3環(huán)序列分析病毒嗜性,比較不同亞型病毒嗜性差異。(4)將pol區(qū)序列提交到美國(guó)斯坦福大學(xué)耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行耐藥預(yù)測(cè)。(5)利用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)300例即將開始抗病毒治療艾滋病患者血漿標(biāo)本的HCV抗體,對(duì)檢出的HCV抗體陽(yáng)性樣本,采用逆轉(zhuǎn)錄巢式-PCR的方法擴(kuò)增、測(cè)定HCV的NCR/C、C/E2和NS5B基因片段,使用COMET軟件和系統(tǒng)進(jìn)化樹的方法確定HCV亞型,分析HIV-1感染者中HCV協(xié)同感染狀況。結(jié)果:(1)773例HIV-1感染者和艾滋病患者中,473例為抗病毒治療失敗的患者、300例為即將開始抗病毒治療的患者,來(lái)自云南省13個(gè)州(市),德宏、臨滄、紅河、昆明四個(gè)地區(qū)的病例最多,均超過整體的10%;感染者來(lái)自多個(gè)民族,以漢族為主(76.1%);感染途徑以異性性傳播為主(73.0%)。(2)獲得gag區(qū)全長(zhǎng)基因596條(擴(kuò)增陽(yáng)性率77.1%)、pol區(qū)基因序列586條(擴(kuò)增陽(yáng)性率75.8%)、env區(qū)基因658條(擴(kuò)增陽(yáng)性率85.1%),拼接獲得gag-pol基因序列526條(68.0%),近似全長(zhǎng)序列50條。(3)獲得了613份樣本的HIV-1亞型結(jié)果,鑒定出12個(gè)HIV-1亞型,主要流行亞型依次為CRF08_BC(53.4%)、CRF01_AE(19.4%)、新型重組毒株URF(12.7%)和CRF07_BC(9.0%)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分型結(jié)果顯示,相同亞型的HIV-1序列在進(jìn)化樹上聚集成簇,URF序列在進(jìn)化樹上分布于各亞型參考序列之間。50條HIV-1近似全長(zhǎng)基因組序列包括30條CRF08_BC、4條CRF07_BC、9條CRF01_AE和7條URF。(4)對(duì)全國(guó)CRF07_BC亞型序列的分析發(fā)現(xiàn),CRF07_BC已經(jīng)傳入了MSM人群,導(dǎo)致這個(gè)毒株在我國(guó)的第二波快速增長(zhǎng)。(5)對(duì)658株病毒進(jìn)行了輔助受體嗜性預(yù)測(cè),其中R5嗜性555株、R5/X4嗜性21株、X4嗜性82株,所有亞型病毒均以R5嗜性為主,X4嗜性病毒在不同亞型中的分布存在差異,CRF01_AE毒株X4嗜性的比例明顯高于其他亞型(P=0.000)。(6)未治療的HIV-1感染者耐藥率為1.5%,抗病毒治療失敗的感染者耐藥率為38.7%,主要耐藥位點(diǎn)為M184V/I和103N/S。(8)HIV-1感染者中HCV抗體的陽(yáng)性率為20.67%。HCV基因擴(kuò)增測(cè)序獲得NCR序列54條,CE/2序列53條和NS5B序列53條。獲得55例HIV-1感染者體內(nèi)協(xié)同感染的HCV亞型結(jié)果,包括3個(gè)基因型7個(gè)基因亞型,依次為3b(45.5%)、6n(16.3%)、1a(10.9%)、3a(10.9%)、1b(9.1%)、6v(5.5%)、6u(1.8%)。結(jié)論:(1)云南省HIV-1毒株高度變異、分布復(fù)雜,在以CRF08_BC占優(yōu)勢(shì)的同時(shí),有11種基因亞型的毒株流行,還有10%以上的新型重組毒株(URF),民族、傳播途徑及不同地區(qū)均顯示毒株亞型分布的差異,提示云南省仍然是我國(guó)新型HIV毒株的主要來(lái)源,需要密切監(jiān)測(cè)。(2)新型重組毒株的重組模式主要有B/C重組和CRF01_AE的參與的重組,前者主要出現(xiàn)在IDU人群,后者多見于性傳播人群。德宏URF毒株的比例高達(dá)34.7%,是重組的熱點(diǎn)地區(qū)和新型流行毒株的起源地。(3)CRF07_BC毒株雖然在云南地區(qū)流行率不高,但已經(jīng)進(jìn)入到MSM人群,是這個(gè)毒株第二波流行的驅(qū)動(dòng)因素,需要加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。(4)云南未治療人群中耐藥毒株的流行較低,但抗病毒治療失敗的人群中耐藥流行率較高,應(yīng)該在開始治療前檢測(cè)病毒耐藥性,保證治療效果;耐藥位點(diǎn)以M184V/I和103N/S為主,在后續(xù)的臨床治療中應(yīng)考慮使用敏感的二線藥物。(5)云南HIV-1感染者中HCV協(xié)同感染率高,流行亞型復(fù)雜,可能會(huì)影響本地的HIV-1感染者疾病進(jìn)程及治療效果,需要進(jìn)一步監(jiān)測(cè)。
【圖文】：

圖 1 系統(tǒng)進(jìn)化方法對(duì) HIV-1 進(jìn)行亞型分析色表示不同 HIV-1 亞型，，熒光綠色表示 CRF08_BC，粉色表示 URF，紅色表_BC，藍(lán)色表示 CRF01_AE。黑色表示參考序列或者是數(shù)目小于 50 的亞型序列。

圖 1 系統(tǒng)進(jìn)化方法對(duì) HIV-1 進(jìn)行亞型分析不同 HIV-1 亞型，熒光綠色表示 CRF08_BC，粉色表示 URF色表示 CRF01_AE。黑色表示參考序列或者是數(shù)目小于 50 的亞型
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R512.91;R181.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2706236