【摘要】：T細胞功能耗竭是持續(xù)性HBV感染的一個重要特征。長期的大量的抗原刺激是導致CHB患者T細胞功能耗竭的一個重要原因，研究表明CD28家族抑制性受體，特別是PD-1在慢乙肝患者耗竭的CD8+T細胞上的表達增加。CD28家族包含兩個協(xié)同刺激性受體（CD28和ICOS），三個抑制性受體（PD-1、CTLA-4和BTLA）。CD28家族五個受體具有同源性，在結構上具有類似特征，且都是免疫球蛋白(Ig)超家族的成員。盡管這些受體在HIV和HCV持續(xù)感染已有大量的研究，但在持續(xù)性HBV感染中的作用研究相對較少，所積累的臨床科研資料更是匱乏。本研究擬以整個CD28家族作為研究對象，探討它們在持續(xù)性HBV感染中外周血T細胞上表達狀況及與血清病毒學指標的相關性，以及體外阻斷PD-1:PD-L1路徑對HBV持續(xù)性感染患者CD4+和CD8+T細胞CD28家族受體表達的影響和T細胞功能的影響。本研究對探討新的慢乙肝的免疫治療方法將具有重要意義。 目的 1.本研究期望通過對CD28家族中的受體（CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4和BTLA）在HBV持續(xù)性感染患者外周血T細胞上表達狀況進行研究，并分析這些分子的表達與CHB患者血清病毒學指標的相關性。 2.通過體外阻斷PD-1:PD-L1路徑，PBMC在體外培養(yǎng)并用HBV特異性多肽,即HLA-A2限制性多肽（AA，18-27，F(xiàn)LPSDFFPSI)刺激，確定阻斷前后HBV持續(xù)性感染患者CD4+和CD8+T細胞CD28家族受體表達情況變化，根據(jù)表達量的變化，判斷阻斷效果并結合臨床指標來評價CD28家族中的受體對HBV持續(xù)性感染患者T細胞功能耗竭的影響。 3.根據(jù)阻斷后T細胞表達效應細胞因子IFN-γ及mRNA水平上表達的轉錄因子T-bet和GATA-3綜合判定PD-1:PD-L1路徑阻斷對CHB患者T細胞功能的影響。探討CHB患者T細胞功能耗竭的可能機制，并從總體上闡明CD28家族中的抑制性受體在持續(xù)性HBV感染中的作用。為我們將來找到治療HBV持續(xù)性感染手段提供一定的參考。 方法 1.總共48位來源于協(xié)和感染性疾病科慢性乙肝患者和26位健康者參與這項研究。 2.肝素抗凝管采取新鮮血液，用泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)密度梯度離心法分離PBMC。分離后的PBMC立即染色進行表型分析。 3.分離后的部分PBMC在96孔（2×105/孔）圓底板上培養(yǎng)10天，并根據(jù)需要加入HBV特異性多肽,即HLA-A2限制性多肽（AA，18-27，F(xiàn)LPSDFFPSI)刺激，并加入Anti-PD-L1用于阻斷PD-1:PD-L1路徑,實驗中還需另外加入同型質(zhì)控抗體作為對照。培養(yǎng)后的細胞用于一部分用于流式檢測CD4+和CD8+T細胞表面CD28家族受體（CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4、BTLA）和胞內(nèi)效應細胞因子IFN-γ的表達；部分PBMC用real-time PCR定量檢測總體的mRNA水平上T細胞轉錄因子：T-bet和GATA-3表達。 4.用商業(yè)化的酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測血清學標志物：HBsAg、anti-HBsAg、HBeAg、anti-HBeAg、anti-HBcAg、anti-HIV（1/2型）、anti-HCV、anti-HDV；用PCR方法進行HLA-A2型別的鑒定；血清中的HBV-DNA用實時定量PCR（real-time PCR）進行定量。 5.統(tǒng)計學分析采用非參數(shù)Mann-Whitney, Wilcoxon matched pairs檢驗和Spearman correlation coefficient檢驗。 結果 1. CD28家族受體總體表達譜不同于健康對照組：相對于正常對照，CHB患者的CD4+T細胞的PD-1、CTLA-4和CD8+T細胞上的ICOS、PD-1和BTLA均顯著升高。 2. CHB患者和健康對照相比，CD28家族同一受體在CD4+和CD8+T細胞上表達的相關性存在差異：CD28、ICOS、PD-1在CHB患者CD4+與CD8+T細胞上的表達表現(xiàn)為正相關，但在健康對照組上CD4+與CD8+T細胞上的表達不相關。但BTLA在健康對照和CHB患者的CD4+與CD8+T細胞上的表達均表現(xiàn)出很好的正相關。 3. CHB患者和健康對照相比，CD28家族不同受體在同一CD4+或CD8+T表達之間的表達存在差異：CD28與CTLA-4在CHB患者CD4+上的表達成負相關，但在健康對照CD4+T細胞上的表達不相關；ICOS與PD-1在CHB患者和健康對照上CD4+T細胞上均表現(xiàn)為正相關；CD28與BTLA在CHB患者CD8+上的表達和健康對照CD8+T細胞上的表達上均成正相關。 4. CHB患者CD8+T細胞上的ICOS、PD-1和BTLA的表達和患者血清中的HBV DNA載量存在相關性，即：HBV DNA載量分別與PD-1、BTLA成正相關，而與ICOS成負相關。 5. CHB患者CD4+和CD8+T細胞在體外PD-1:PD-L1路徑阻斷后： （1）總體的CD28家族受體的表達譜發(fā)生顯著改變，CD4+細胞上CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4的表達顯著上調(diào)，且CD4+T細胞上的CD28和ICOS倍數(shù)改變成正相關，CD4+T細胞上的CTLA-4分別同CD28、ICOS、PD-1均成正相關。但CD8+T細胞上CD28家族受體的表達沒有顯著變化。另外，PD-1:PD-L1路徑阻斷后CD4+細胞上PD-1的表達與HBV DNA載量成正相關。 （2）CD4+胞內(nèi)IFN-γ表達升高，且其倍數(shù)改變與阻斷后CD4+T細胞上ICOS表達的倍數(shù)改變成正相關，而與CD4+T細胞上PD-1表達的倍數(shù)改變成負相關；CD8+T細胞在PD-1:PD-L1路徑阻斷后，胞內(nèi)IFN-γ表達沒有顯著改變。 （3）總體的PBMC轉錄因子T-bet和GATA-3mRNA表達上調(diào)，且兩者的倍數(shù)改變成正相關，但T-bet的倍數(shù)改變更為明顯；PD-1:PD-L1路徑阻斷后，T-bet:GATA-31.3時，CD4+T細胞胞內(nèi)IFN-γ表達較T-bet:GATA-31.3時更高。 結論 1.與健康對照相比，CHB患者CD4+或CD8+T細胞上CD28家族中某些受體的表達量及不同受體在同一細胞或同一細胞表達不同受體的相關性上發(fā)生改變，提示這些變化可能是CD28家族受體在CHB患者T細胞上表達的生物學特征，或是其發(fā)生功能耗竭的原因。 2. CHB患者CD8+T細胞上的PD-1和BTLA的表達和患者血清中的HBV DNA載量存在正相關，而ICOS與HBV DNA載量存在負相關，提示這三個分子與HBV在體內(nèi)的復制可能互為因果關系。提示我們將來利用可利用這三個分子作為靶標作為研究對象，為其最終用于臨床治療提供參考。 3.體外阻斷PD-1:PD-L1路徑，可引起T細胞上CD28家族受體的表達發(fā)生變化，并且不同受體之間和受體與HBV DNA水平存在相互聯(lián)系，提示我們運用經(jīng)典PD-1:PD-L1或其它新的阻斷路徑的同時，要充分考慮由其帶來的其它分子的消長變化所帶來的影響，從而對阻斷效果作慎重評估。 4.體外阻斷PD-1:PD-L1路徑，只能使CD4+胞內(nèi)IFN-γ表達升高，而CD8+T細胞胞內(nèi)IFN-γ表達沒有顯著改變，且CD4+胞內(nèi)IFN-γ倍數(shù)改變與其細胞上ICOS表達的倍數(shù)改變成正相關，而與PD-1表達的倍數(shù)改變成負相關，提示我們將來用單一PD-1:PD-L1路徑阻斷方法用于CHB患者治療作用有限，且要根據(jù)其它分子的表達狀況，考慮是否采用或選擇最佳時機。 5.體外PD-1:PD-L1路徑阻斷能使CHB患者總體的T細胞胞內(nèi)轉錄因子T-betmRNA表達水平相對于GATA-3mRNA水平升高更為顯著，且T-bet:GATA-3比率較大時更有利于CD4+T細胞胞內(nèi)IFN-γ表達。 本研究的創(chuàng)新點 1.本項目立于國際前沿研究，充分依據(jù)現(xiàn)有理論成果，創(chuàng)新性提出將整個CD28家族受體（CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4、BTLA）作為研究對象，研究它們在健康者與CHB患者外周總體T細胞表達狀況，并分析健康人與病人之間、不同細胞之間、受體與受體之間和受體的表達與臨床指標之間的差異或相關性，最終目標是系統(tǒng)分析CD28家族中受體在持續(xù)性HBV感染中的作用，而目前國內(nèi)外均尚未見類似系統(tǒng)性、綜合性的研究。 2.首次將經(jīng)典PD-1:PD-L1路徑阻斷方法引入到對整個CD28家族受體研究中，考察并分析阻斷前后CD28家族中5個受體表達各自消長情況，受體之間的相互關系。從而分析PD-1:PD-L1阻斷對CHB患者的T細胞表達CD28家族受體的影響及這些受體的表達的改變與臨床指標的聯(lián)系，使PD-1:PD-L1路徑阻斷臨床研究更具客觀性、具體性、整體性。 3.利用胞內(nèi)表達T-bet、GATA-3mRNA和IFN-γ水平聯(lián)合評定PD-1:PD-L1路徑阻斷效果，檢驗耗竭的T細胞功能改善狀況，且分析它們與CHB患者病毒學指標之間的關系。并根據(jù)分子生物學和免疫學基本原理進行立體分析，從理論上回答CD28家族中受體在持續(xù)HBV感染中的作用，以實現(xiàn)研究目標。 本研究的意義 本項目考慮到CD28家族成員本身的一些共性特點，將其刺激性受體和抑制性受體作為整體用于HBV持續(xù)性感染患者的分析研究中。項目一方面有望通過調(diào)查持續(xù)性HBV感染患者外周血T細胞CD28家族中的受體表達水平，以及病毒學指標相關性的分析，闡明CD28家族中受體在持續(xù)性HBV感染中的作用；另一方面是研究PD-1:PD-L1阻斷對CHB患者的T細胞表達CD28家族受體及胞內(nèi)細胞因子的表達的影響，并結合臨床資料綜合分析、立體分析單一PD-1:PD-L1路徑阻斷的優(yōu)缺點，從而為將來臨床開發(fā)和利用新的免疫學的治療方法或新的治療靶點提供一定的理論依據(jù)，，減少CHB患者長期治療的毒性問題，從而最終減輕患者的經(jīng)濟上的負擔。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 孫學華;劉巧麗;李曼;高月求;;慢性乙型肝炎患者CD4~+和CD8~+T細胞亞群的研究[J];細胞與分子免疫學雜志;2011年05期

2 ;T-bet/GATA-3 ratio is a surrogate measure of Th_1/Th_2 cytokine profiles and may be novel targets for CpG ODN treatment in asthma patients[J];Chinese Medical Journal;2006年16期

3 彭國平;孫雯;孫箴;朱嘉s

本文編號：2705118