CD28家族受體對慢性HBV感染的影響及其機(jī)制的研究
發(fā)布時間:2020-06-09 19:09
【摘要】:T細(xì)胞功能耗竭是持續(xù)性HBV感染的一個重要特征。長期的大量的抗原刺激是導(dǎo)致CHB患者T細(xì)胞功能耗竭的一個重要原因,研究表明CD28家族抑制性受體,特別是PD-1在慢乙肝患者耗竭的CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)增加。CD28家族包含兩個協(xié)同刺激性受體(CD28和ICOS),三個抑制性受體(PD-1、CTLA-4和BTLA)。CD28家族五個受體具有同源性,在結(jié)構(gòu)上具有類似特征,且都是免疫球蛋白(Ig)超家族的成員。盡管這些受體在HIV和HCV持續(xù)感染已有大量的研究,但在持續(xù)性HBV感染中的作用研究相對較少,所積累的臨床科研資料更是匱乏。本研究擬以整個CD28家族作為研究對象,探討它們在持續(xù)性HBV感染中外周血T細(xì)胞上表達(dá)狀況及與血清病毒學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性,以及體外阻斷PD-1:PD-L1路徑對HBV持續(xù)性感染患者CD4+和CD8+T細(xì)胞CD28家族受體表達(dá)的影響和T細(xì)胞功能的影響。本研究對探討新的慢乙肝的免疫治療方法將具有重要意義。 目的 1.本研究期望通過對CD28家族中的受體(CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4和BTLA)在HBV持續(xù)性感染患者外周血T細(xì)胞上表達(dá)狀況進(jìn)行研究,并分析這些分子的表達(dá)與CHB患者血清病毒學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。 2.通過體外阻斷PD-1:PD-L1路徑,PBMC在體外培養(yǎng)并用HBV特異性多肽,即HLA-A2限制性多肽(AA,18-27,F(xiàn)LPSDFFPSI)刺激,確定阻斷前后HBV持續(xù)性感染患者CD4+和CD8+T細(xì)胞CD28家族受體表達(dá)情況變化,根據(jù)表達(dá)量的變化,判斷阻斷效果并結(jié)合臨床指標(biāo)來評價(jià)CD28家族中的受體對HBV持續(xù)性感染患者T細(xì)胞功能耗竭的影響。 3.根據(jù)阻斷后T細(xì)胞表達(dá)效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ及mRNA水平上表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3綜合判定PD-1:PD-L1路徑阻斷對CHB患者T細(xì)胞功能的影響。探討CHB患者T細(xì)胞功能耗竭的可能機(jī)制,并從總體上闡明CD28家族中的抑制性受體在持續(xù)性HBV感染中的作用。為我們將來找到治療HBV持續(xù)性感染手段提供一定的參考。 方法 1.總共48位來源于協(xié)和感染性疾病科慢性乙肝患者和26位健康者參與這項(xiàng)研究。 2.肝素抗凝管采取新鮮血液,用泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)密度梯度離心法分離PBMC。分離后的PBMC立即染色進(jìn)行表型分析。 3.分離后的部分PBMC在96孔(2×105/孔)圓底板上培養(yǎng)10天,并根據(jù)需要加入HBV特異性多肽,即HLA-A2限制性多肽(AA,18-27,F(xiàn)LPSDFFPSI)刺激,并加入Anti-PD-L1用于阻斷PD-1:PD-L1路徑,實(shí)驗(yàn)中還需另外加入同型質(zhì)控抗體作為對照。培養(yǎng)后的細(xì)胞用于一部分用于流式檢測CD4+和CD8+T細(xì)胞表面CD28家族受體(CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4、BTLA)和胞內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá);部分PBMC用real-time PCR定量檢測總體的mRNA水平上T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子:T-bet和GATA-3表達(dá)。 4.用商業(yè)化的酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測血清學(xué)標(biāo)志物:HBsAg、anti-HBsAg、HBeAg、anti-HBeAg、anti-HBcAg、anti-HIV(1/2型)、anti-HCV、anti-HDV;用PCR方法進(jìn)行HLA-A2型別的鑒定;血清中的HBV-DNA用實(shí)時定量PCR(real-time PCR)進(jìn)行定量。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用非參數(shù)Mann-Whitney, Wilcoxon matched pairs檢驗(yàn)和Spearman correlation coefficient檢驗(yàn)。 結(jié)果 1. CD28家族受體總體表達(dá)譜不同于健康對照組:相對于正常對照,CHB患者的CD4+T細(xì)胞的PD-1、CTLA-4和CD8+T細(xì)胞上的ICOS、PD-1和BTLA均顯著升高。 2. CHB患者和健康對照相比,CD28家族同一受體在CD4+和CD8+T細(xì)胞上表達(dá)的相關(guān)性存在差異:CD28、ICOS、PD-1在CHB患者CD4+與CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)表現(xiàn)為正相關(guān),但在健康對照組上CD4+與CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)不相關(guān)。但BTLA在健康對照和CHB患者的CD4+與CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)均表現(xiàn)出很好的正相關(guān)。 3. CHB患者和健康對照相比,CD28家族不同受體在同一CD4+或CD8+T表達(dá)之間的表達(dá)存在差異:CD28與CTLA-4在CHB患者CD4+上的表達(dá)成負(fù)相關(guān),但在健康對照CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)不相關(guān);ICOS與PD-1在CHB患者和健康對照上CD4+T細(xì)胞上均表現(xiàn)為正相關(guān);CD28與BTLA在CHB患者CD8+上的表達(dá)和健康對照CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)上均成正相關(guān)。 4. CHB患者CD8+T細(xì)胞上的ICOS、PD-1和BTLA的表達(dá)和患者血清中的HBV DNA載量存在相關(guān)性,即:HBV DNA載量分別與PD-1、BTLA成正相關(guān),而與ICOS成負(fù)相關(guān)。 5. CHB患者CD4+和CD8+T細(xì)胞在體外PD-1:PD-L1路徑阻斷后: (1)總體的CD28家族受體的表達(dá)譜發(fā)生顯著改變,CD4+細(xì)胞上CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4的表達(dá)顯著上調(diào),且CD4+T細(xì)胞上的CD28和ICOS倍數(shù)改變成正相關(guān),CD4+T細(xì)胞上的CTLA-4分別同CD28、ICOS、PD-1均成正相關(guān)。但CD8+T細(xì)胞上CD28家族受體的表達(dá)沒有顯著變化。另外,PD-1:PD-L1路徑阻斷后CD4+細(xì)胞上PD-1的表達(dá)與HBV DNA載量成正相關(guān)。 (2)CD4+胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)升高,且其倍數(shù)改變與阻斷后CD4+T細(xì)胞上ICOS表達(dá)的倍數(shù)改變成正相關(guān),而與CD4+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)的倍數(shù)改變成負(fù)相關(guān);CD8+T細(xì)胞在PD-1:PD-L1路徑阻斷后,胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)沒有顯著改變。 (3)總體的PBMC轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3mRNA表達(dá)上調(diào),且兩者的倍數(shù)改變成正相關(guān),但T-bet的倍數(shù)改變更為明顯;PD-1:PD-L1路徑阻斷后,T-bet:GATA-31.3時,CD4+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)較T-bet:GATA-31.3時更高。 結(jié)論 1.與健康對照相比,CHB患者CD4+或CD8+T細(xì)胞上CD28家族中某些受體的表達(dá)量及不同受體在同一細(xì)胞或同一細(xì)胞表達(dá)不同受體的相關(guān)性上發(fā)生改變,提示這些變化可能是CD28家族受體在CHB患者T細(xì)胞上表達(dá)的生物學(xué)特征,或是其發(fā)生功能耗竭的原因。 2. CHB患者CD8+T細(xì)胞上的PD-1和BTLA的表達(dá)和患者血清中的HBV DNA載量存在正相關(guān),而ICOS與HBV DNA載量存在負(fù)相關(guān),提示這三個分子與HBV在體內(nèi)的復(fù)制可能互為因果關(guān)系。提示我們將來利用可利用這三個分子作為靶標(biāo)作為研究對象,為其最終用于臨床治療提供參考。 3.體外阻斷PD-1:PD-L1路徑,可引起T細(xì)胞上CD28家族受體的表達(dá)發(fā)生變化,并且不同受體之間和受體與HBV DNA水平存在相互聯(lián)系,提示我們運(yùn)用經(jīng)典PD-1:PD-L1或其它新的阻斷路徑的同時,要充分考慮由其帶來的其它分子的消長變化所帶來的影響,從而對阻斷效果作慎重評估。 4.體外阻斷PD-1:PD-L1路徑,只能使CD4+胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)升高,而CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)沒有顯著改變,且CD4+胞內(nèi)IFN-γ倍數(shù)改變與其細(xì)胞上ICOS表達(dá)的倍數(shù)改變成正相關(guān),而與PD-1表達(dá)的倍數(shù)改變成負(fù)相關(guān),提示我們將來用單一PD-1:PD-L1路徑阻斷方法用于CHB患者治療作用有限,且要根據(jù)其它分子的表達(dá)狀況,考慮是否采用或選擇最佳時機(jī)。 5.體外PD-1:PD-L1路徑阻斷能使CHB患者總體的T細(xì)胞胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T-betmRNA表達(dá)水平相對于GATA-3mRNA水平升高更為顯著,且T-bet:GATA-3比率較大時更有利于CD4+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn) 1.本項(xiàng)目立于國際前沿研究,充分依據(jù)現(xiàn)有理論成果,創(chuàng)新性提出將整個CD28家族受體(CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4、BTLA)作為研究對象,研究它們在健康者與CHB患者外周總體T細(xì)胞表達(dá)狀況,并分析健康人與病人之間、不同細(xì)胞之間、受體與受體之間和受體的表達(dá)與臨床指標(biāo)之間的差異或相關(guān)性,最終目標(biāo)是系統(tǒng)分析CD28家族中受體在持續(xù)性HBV感染中的作用,而目前國內(nèi)外均尚未見類似系統(tǒng)性、綜合性的研究。 2.首次將經(jīng)典PD-1:PD-L1路徑阻斷方法引入到對整個CD28家族受體研究中,考察并分析阻斷前后CD28家族中5個受體表達(dá)各自消長情況,受體之間的相互關(guān)系。從而分析PD-1:PD-L1阻斷對CHB患者的T細(xì)胞表達(dá)CD28家族受體的影響及這些受體的表達(dá)的改變與臨床指標(biāo)的聯(lián)系,使PD-1:PD-L1路徑阻斷臨床研究更具客觀性、具體性、整體性。 3.利用胞內(nèi)表達(dá)T-bet、GATA-3mRNA和IFN-γ水平聯(lián)合評定PD-1:PD-L1路徑阻斷效果,檢驗(yàn)耗竭的T細(xì)胞功能改善狀況,且分析它們與CHB患者病毒學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系。并根據(jù)分子生物學(xué)和免疫學(xué)基本原理進(jìn)行立體分析,從理論上回答CD28家族中受體在持續(xù)HBV感染中的作用,以實(shí)現(xiàn)研究目標(biāo)。 本研究的意義 本項(xiàng)目考慮到CD28家族成員本身的一些共性特點(diǎn),將其刺激性受體和抑制性受體作為整體用于HBV持續(xù)性感染患者的分析研究中。項(xiàng)目一方面有望通過調(diào)查持續(xù)性HBV感染患者外周血T細(xì)胞CD28家族中的受體表達(dá)水平,以及病毒學(xué)指標(biāo)相關(guān)性的分析,闡明CD28家族中受體在持續(xù)性HBV感染中的作用;另一方面是研究PD-1:PD-L1阻斷對CHB患者的T細(xì)胞表達(dá)CD28家族受體及胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)的影響,并結(jié)合臨床資料綜合分析、立體分析單一PD-1:PD-L1路徑阻斷的優(yōu)缺點(diǎn),從而為將來臨床開發(fā)和利用新的免疫學(xué)的治療方法或新的治療靶點(diǎn)提供一定的理論依據(jù),,減少CHB患者長期治療的毒性問題,從而最終減輕患者的經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。
【學(xué)位授予單位】:華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2013
【分類號】:R512.62
【學(xué)位授予單位】:華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2013
【分類號】:R512.62
【參考文獻(xiàn)】
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1 孫學(xué)華;劉巧麗;李曼;高月求;;慢性乙型肝炎患者CD4~+和CD8~+T細(xì)胞亞群的研究[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年05期
2 ;T-bet/GATA-3 ratio is a surrogate measure of Th_1/Th_2 cytokine profiles and may be novel targets for CpG ODN treatment in asthma patients[J];Chinese Medical Journal;2006年16期
3 彭國平;孫雯;孫箴;朱嘉s
本文編號:2705118
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