【摘要】：研究背景:基于全球的腫瘤登記數(shù)據(jù),肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)病率在男性和女性腫瘤中分別位列第五位和第九位,而每年因HCC而死亡的患者,在男性和女性腫瘤中排列為第二位和第六位。中國每年新發(fā)HCC和因其死亡人數(shù)均約占到世界范圍內(nèi)的50%左右。我國HCC患者絕大部分是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染導(dǎo)致的;而且HBV慢性感染人群基數(shù)龐大,這是引起HCC高發(fā)的最主要原因之一。HBV large S基因(preS1/preS2/S)編碼了病毒顆粒的表面蛋白,是病毒感染肝細(xì)胞、機(jī)體抗原識別表位和引起HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵影響因素。前期大量的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,該基因片段preS區(qū)的相關(guān)變異是促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的危險因素。但是何種preS變異序列,以及這些變異是通過何種機(jī)制導(dǎo)致了HCC的發(fā)生,目前尚無相關(guān)研究能夠完全闡明。研究目的:證實影響HBV慢性感染患者發(fā)生HCC的危險因素,闡明何種HBV preS區(qū)的基因變異能促進(jìn)HCC的發(fā)生;在體外實驗中,發(fā)現(xiàn)這些變異序列所引起的癌癥相關(guān)表型的改變和調(diào)控的下游基因與其作用機(jī)制;在體內(nèi)實驗中,驗證large S序列及變異的致炎、致癌效果。為后續(xù)如何預(yù)防慢性HBV感染患者發(fā)生HCC和進(jìn)行相應(yīng)的治療,提供理論依據(jù)。研究方法:應(yīng)用納入2114位HBV慢性感染者隊列,設(shè)計特異性引物擴(kuò)增患者外周血中HBV基因組preS區(qū)片段,采用sanger測序的方法,序列比對后鑒定相關(guān)preS變異。納入患者人口學(xué)資料、臨床一般信息和治療信息等,采用COX單因素和多因素風(fēng)險回歸模型分析方法,促進(jìn)HCC發(fā)生和患者肝病相關(guān)死亡的風(fēng)險因素。應(yīng)用HBV large S基因野生型和篩選出的三種變異型序列,構(gòu)建相關(guān)慢病毒載體,轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系;通過檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、裸鼠皮下荷瘤等表型,觀察相關(guān)基因序列對細(xì)胞惡性表型的影響。測定不同細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)譜芯片,比較分析large S基因及其變異調(diào)控的下游基因。通過實時熒光定量PCR(reverse transcription quantitative PCR,RT-qPCR)、免疫印跡實驗(Western Blot,WB)等分子生物學(xué)實驗研究其可能的調(diào)控機(jī)制。將相關(guān)基因序列構(gòu)建Sleeping Beauty相關(guān)載體,用尾靜脈注射的方式表達(dá)于小鼠肝臟。闡明變異型large S基因所致小鼠肝臟炎癥狀態(tài)和肝細(xì)胞癌的發(fā)生情況。通過小鼠肝臟RNA表達(dá)譜芯片的測定,比較分析large S基因及相關(guān)變異在動物體內(nèi)的調(diào)控的基因及參與的信號通路。后續(xù)相關(guān)分子的免疫組化等實驗來驗證靶分子的表達(dá)水平,進(jìn)一步驗證large S基因及其變異調(diào)控的作用機(jī)制。研究結(jié)果:該研究第一部分,人群隊列的研究結(jié)果顯示,2114例HBV慢性感染患者隊列,隨訪的中位時間為8.92年,總共隨訪18406人年。在隨訪期間內(nèi),共有209例患者發(fā)生HCC,發(fā)生率為9.89%(209/2114)。經(jīng)COX回歸分析后,我們得出男性患者、高年齡患者、肝硬化、HBV C2基因亞型、未使用抗病毒治療、高直接膽紅素(7mmol/L)、甲胎蛋白陽性、低白蛋白水平(35g/L)、低血小板計數(shù)(100×10~9 g/L)是促進(jìn)HCC發(fā)生的危險因素(P0.05)。此外,HBV基因組preS區(qū)中C3116T和T31C突變促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展。在HBV慢性感染者體內(nèi),C2為主要基因亞型(73.1%),由C2基因亞型所引起的HCC發(fā)生,占83.3%(125/150)。HBV C2基因亞型相關(guān)preS變異,如G2950A、G2951A、A2962G、C2964A、A3054T、C3063G、T3069G和A3120T,均促進(jìn)了HCC的發(fā)生。preS區(qū)相關(guān)變異的組合,如G2950A/G2951A/A2962G/C2964A(mutation 1),促進(jìn)了HCC的發(fā)生(HR 2.51,95%CI,1.10-5.74;P=0.030);聯(lián)合突變C3116T/T31C(mutation 2)變異也增加了HBV慢性感染患者HCC的發(fā)病風(fēng)險(HR1.57,95%CI,1.07-2.31;P=0.022)。此外,preS2 deletion(5bp)在使用抗病毒治療的人群中,促進(jìn)了HCC發(fā)生(HR 2.81,95%CI,1.27-6.22;P=0.011)。課題第二部分,體外實驗結(jié)果顯示,HBV large S基因deletion序列較wild type序列顯著提高了細(xì)胞增殖能力、軟瓊脂克隆能力和裸鼠皮下荷瘤能力(P0.05)。但三種變異型large S序列(mutation 1、mutation 2和deletion)對細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等細(xì)胞轉(zhuǎn)移運(yùn)動能力沒有提升,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在轉(zhuǎn)染目的基因后,mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,野生型large S基因主要影響了細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)進(jìn)程。Mutation 1、mutation 2和deletion序列與wild type基因比較后發(fā)現(xiàn),三種變異均降低了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)基因的表達(dá),并上調(diào)了癌癥相關(guān)的信號通路�；蚨康慕Y(jié)果也證實了促進(jìn)凋亡的相關(guān)基因OLR和PMAIP1在變異組中低于wild type組,且抑制凋亡基因BIRC3和BIRC2則在變異組中高于wild type組。癌癥相關(guān)基因的表達(dá)水平,如STAT3信號通路在deletion組中,其表達(dá)水平較wild type組高(P=0.027)。Western blot實驗的結(jié)果顯示,STAT3分子的表達(dá)水平在三種變異組中高于野生型large S組,但磷酸化后的p-STAT3蛋白表達(dá)量在各組間未見明顯差異。在STAT3分子抑制劑stattic作用下,各組間的細(xì)胞增殖趨于一致。而在STAT3信號通路激動劑IL-6作用下,各組間的細(xì)胞增殖能力有顯著的提高,并增大了組間差異。相關(guān)交互作用分析顯示,三種變異型large S基因與炎癥因子,協(xié)同通過IL-6/STAT3信號通路促進(jìn)了HepG2細(xì)胞的增殖。通過構(gòu)建好的小鼠模型,發(fā)現(xiàn)3種變異型large S基因?qū)е滦∈蟮纳嫫谑艿讲煌潭鹊慕档汀ＨN變異型基因(mutation 1、mutation 2和deletion)引起小鼠肝臟腫瘤的發(fā)生率,較wild type有不同程度的提高,分別為36.4%(4/11)、57.1%(4/7)、66.7%(4/6),(P_(trend)=0.023)。肝臟實物圖和HE染色鏡下可見表達(dá)HBV large S基因的小鼠肝臟炎癥狀態(tài)明顯,肝細(xì)胞呈現(xiàn)出水腫、變性;在嚴(yán)重擠壓狀態(tài)下,肝臟特征性結(jié)構(gòu)不明顯。肝癌相關(guān)特異性分子CK18、細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67和PCNA的免疫組化評分,在mutation 1、mutation 2和deletion組中均較vector組或wild type組顯著提高(P0.05)。小鼠肝臟的mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示:野生型large S基因的表達(dá),調(diào)節(jié)了細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)激,以及癌癥相關(guān)相關(guān)信號的激活。Mutation 1、mutation 2和preS2 deletion序列的表達(dá)后與野生型large S基因比較,這些相關(guān)均進(jìn)一步的上調(diào)了小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)炎癥與癌癥相關(guān)基因集,以及癌癥相關(guān)信號通路的激活。小鼠外周血中相關(guān)分子ELISA結(jié)果顯示,炎-癌轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)胞因子IL-5、IL-6和IL-12均表現(xiàn)為,wild type組中的表達(dá)較vector組高,而三種變異型組較wild type組高。此外,表達(dá)三種變異型large S基因的小鼠肝臟中,STAT3和p-STAT3分子的表達(dá)評分均較vector組與wild type組高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。上述結(jié)果表明,三種large S基因變異,尤其是preS2 deletion可與小鼠體內(nèi)的炎癥狀態(tài),共同通過激活I(lǐng)L-6/STAT3相關(guān)信號通路,進(jìn)而促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展。研究結(jié)論:本課題通過隊列研究證實了眾多臨床指標(biāo)和HBV基因preS區(qū)相關(guān)突變是慢乙肝患者發(fā)生HCC的危險因素。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)preS區(qū)的組合突變(G2950A/G2951A/A2962G/C2964A,C3116T/T31C和preS2 deletion),具有促進(jìn)慢性HBV感染者發(fā)生HCC的作用。在體外實驗中,證實三種變異型large S基因,尤其是preS2 deletion序列可通過上調(diào)STAT3分子的表達(dá),激活癌癥相關(guān)信號通路,促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展。小鼠模型中,也證實了三種變異型large S基因的表達(dá)具有促進(jìn)小鼠肝臟炎癥、癌癥的作用。本課題充分解釋了HBV large S基因preS區(qū)相關(guān)突變促癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制,為防控HCC的發(fā)生,提供了新的思路。
【圖文】：

軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文隊列的構(gòu)建：3304 例慢性 HBV 感染患者在初步納入本隊列后，，排除 512 例患有失代償性不符合該研究的肝病患者； 86 例在電話確認(rèn)后拒絕參加該研究的患者； 存在其它肝炎病毒混合型感染；117 例未收集到生物樣本（即足夠用于相關(guān)清）。在時間節(jié)點(diǎn) 2008 年 1 月后，即開始進(jìn)行隊列的患者初次確認(rèn)與隨訪，86 例在初次隨訪就聯(lián)系不上的患者；289 例未完成持續(xù) 48 周的抗病毒治療或方案頻繁更改、抗病毒治療過程不明確；23例患者在納入隊列后1年內(nèi)發(fā)生H上述排除標(biāo)準(zhǔn)和隨訪開始后排除的患者，共有 1190 例患者被排除在本隊列最終剩余 2114 例患者符合本項目研究（圖 1-1）。

- 35 -圖 1-2. preS 區(qū)聯(lián)合突變 G2950A/G2951A/A2962G/C2964A 在 C2 基因型 HBV 慢性感染中對 HCC 發(fā)生和患者肝病相關(guān)死亡的影響（a.聯(lián)合突變 mutation 1 在 CHB 患者中促進(jìn) HCC 發(fā)生；b. 聯(lián)合突變 mutation 1 促進(jìn) CHB 患者死亡情況；c. 聯(lián)合突變 mutation 1 在非抗病毒患者中影響 HCC 發(fā)生情況；d. 聯(lián)合突變 mutation 1影響非抗病毒患者的死亡情況；e. 聯(lián)合突變 mutation 1 在抗病毒患者中影響 HCC 發(fā)生情況；f. 聯(lián)合突變 mutation 1 影響抗病毒患者的死亡情況。）
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R512.62;R735.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 俞靜;;我們身體里的“幽靈”基因[J];大自然探索;2016年12期

2 何祥火,李錦軍,解翼虎,張鋒銳,曲淑敏,唐耘天,覃文新,萬大方,顧健人;新基因CT120在肺癌組織中的表達(dá)及其對細(xì)胞生長的影響[J];癌癥;2003年02期

3 曾以申;;農(nóng)作物抗病基因探索的回顧和展望[J];生物科學(xué)信息;1989年02期

4 周曉敏;;基因檢測:吃藥沒用?[J];消費(fèi)者報道;2013年03期

5 周怡;;以紅色基因為載體培育和踐行社會主義核心價值觀[J];青春歲月;2018年23期

6 屠鞠傳禮;呂貫廷;曾長青;;人類基因組中巢式基因?qū)Φ南到y(tǒng)分析[J];遺傳;2010年09期

7 陳秋蓮,李陶深;“好”基因?qū)ψ袁F(xiàn)及其在遺傳算法協(xié)同演化中的應(yīng)用研究[J];廣西科學(xué)院學(xué)報;2001年04期

8 黃大年;楊煒;王金霞;范在豐;鄒勤;何祖華;申宗坦;;利用遺傳同質(zhì)的近等基因?qū)ρ芯克究沟疚敛』虻漠a(chǎn)物[J];中國水稻科學(xué);1992年02期

9 李建婷;郭成;侯巖峰;焦玉蓮;趙躍然;孫慧;徐進(jìn);曹銘鋒;高聆;趙家軍;張海清;李明龍;;橋本甲狀腺炎患者殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體與人類白細(xì)胞抗原基因?qū)︻l率的分析[J];中國免疫學(xué)雜志;2014年01期

10 王琳琳;;關(guān)于優(yōu)化高中生物《基因?qū)π誀畹目刂啤芬徽n教學(xué)的探討[J];考試周刊;2016年73期

相關(guān)會議論文 前10條

1 楊乃蘇;穆琳;趙博昊;胡帥帥;王曼曼;陳陽;吳信生;;兔SLC7A11基因敲降對黑色素生成相關(guān)基因表達(dá)的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會養(yǎng)兔學(xué)分會第二屆學(xué)術(shù)交流大會論文集[C];2018年

2 饒進(jìn)軍;徐偉;吳曙光;;導(dǎo)入外源性P53基因?qū)L1520復(fù)制的影響[A];中國藥理學(xué)會第八次全國代表大會論文摘要集（第二部分）[C];2002年

3 尚世強(qiáng);;基因與健康[A];2016年浙江省檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2016年

4 宋久剛;謝華紅;杜瑞;高娟;劉杰;樊代明;;URG4基因?qū)IH3T3細(xì)胞的惡性誘導(dǎo)作用[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國消化病學(xué)術(shù)會議論文匯編（下冊）[C];2007年

5 姜靜;王銀磊;趙麗萍;周蓉;李亞茹;趙統(tǒng)敏;余文貴;;番茄熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選[A];第七屆長三角園藝論壇論文集[C];2016年

6 饒進(jìn)軍;徐偉;吳曙光;;導(dǎo)入外源性P53基因?qū)L1520復(fù)制的影響[A];中國藥理學(xué)會第八次全國代表大會暨全國藥理學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

7 陳輝;王魯文;褚小剛;嚴(yán)少南;龔作炯;;APOBEC3G基因?qū)epG_2 2.2.15細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[A];全國第3屆中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會議暨中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會傳染病專業(yè)委員會第2屆委員會議論文匯編[C];2010年

8 張建;張建華;許曉群;宗金寶;田志剛;;白細(xì)胞介素15和干細(xì)胞因子基因?qū)K細(xì)胞殺傷相關(guān)分子的調(diào)節(jié)作用[A];第八屆全國腫瘤生物治療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2004年

9 馬玉彥;李殿俊;解麗華;陳瓊;賈曉剛;;轉(zhuǎn)IL-2基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞藥物敏感性的影響[A];慶祝黑龍江省免疫學(xué)會成立十周年（1993—2003）論文集[C];2003年

10 朱明珠;高磊;李霞;;酵母基因表達(dá)相關(guān)性與蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)距離分析[A];中國生物醫(yī)學(xué)工程進(jìn)展——2007中國生物醫(yī)學(xué)工程聯(lián)合學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 汪永安;皖企首獲基因檢測資質(zhì)[N];安徽日報;2017年

2 記者 白竟楠;世界首例基因編輯克隆犬誕生，來定制寵物吧![N];北京科技報;2017年

3 本報記者 馬愛平;好甜還是喜咸，基因說了算？[N];科技日報;2017年

4 記者 張小軍;決定老鼠性別基因被發(fā)現(xiàn)[N];新華每日電訊;2001年

5 盧菁;怕胖可就是管不住嘴,原是基因作怪[N];新華每日電訊;2008年

6 吳一福;四軍醫(yī)大首次發(fā)現(xiàn)人腦抑癌新基因[N];中國醫(yī)藥報;2005年

7 Linda Villarosa著 黎明 譯;抗癌的代價：細(xì)胞老化[N];科技日報;2002年

8 記者 毛黎;iPS生成過程得到極大簡化[N];科技日報;2008年

9 記者 齊芳;影響小鼠壽命的基因也會影響人嗎 我科學(xué)家：差異非常大[N];光明日報;2018年

10 周吉芳 美國伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)研究者;基因檢測:從科研到商業(yè)運(yùn)用需更理性[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2018年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李自雄;乙肝病毒large S基因及其變異促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

2 王佚;mdr1基因在兔VX2肝癌化療中骨髓保護(hù)及治療作用的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

3 鄒嵐;放射啟動MIP-3α基因激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 王蒙;人TALL-1基因的克隆、表達(dá)和生物學(xué)活性研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

5 何勇;p73基因在人肺癌中的表達(dá)及對其細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

6 孫照剛;傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白G基因的克隆、表達(dá)、蛋白功能研究以及缺失該基因病毒的重組[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

7 吳漢林;人NIT1基因cDNA的克隆、原核表達(dá)及抗體制備[D];四川大學(xué);2005年

8 樸春姬;hTRAIL基因—放射治療的體外抑瘤效應(yīng)及其機(jī)制的實驗研究[D];吉林大學(xué);2006年

9 金旭;心血管內(nèi)靶向定位基因遞送體系—載基因支架的實驗研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

10 王建東;卵巢癌相關(guān)腫瘤抗原新基因的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 徐凱凱;p27~(kip1)基因在紅系發(fā)育過程中的功能研究[D];鄭州大學(xué);2018年

2 許金云;BIM基因內(nèi)含子2缺失與兒童免疫性血小板減少癥對糖皮質(zhì)激素耐藥的相關(guān)性研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

3 溫向娜;紅色基因傳承與社會主義核心價值觀培育研究[D];南昌大學(xué);2018年

4 張瑩姣;MiR-194-5p靶向BCKDHA基因調(diào)控綿羊脂肪生成機(jī)制的研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

5 吳海彥;COL11A1和COL18A1基因與近視相關(guān)性分析及近視易感基因SNTB1相關(guān)功能研究[D];電子科技大學(xué);2018年

6 姜蘇珊;中國漢族人群LIPA基因rs 1051338、rs 1412444多態(tài)性與NAFLD的相關(guān)性研究[D];青島大學(xué);2018年

7 李曉琳;IL-2基因rs2069763、IL-10基因rs1800872位點(diǎn)多態(tài)性與乙肝相關(guān)性肝癌的相關(guān)性研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2017年

8 龔明星;腫瘤驅(qū)動基因的分析預(yù)測及其在肝癌中功能的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

9 陳建武;CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)豬MSTN基因定點(diǎn)修飾研究[D];長江大學(xué);2017年

10 聶麗君;高校傳承紅色基因?qū)Σ哐芯縖D];江西財經(jīng)大學(xué);2017年

本文編號：2703223