【摘要】：目的:肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)居我國(guó)惡性腫瘤死亡率的第三位,并且呈逐年上升趨勢(shì)。大部分的肝癌患者在晚期才被確診出,因此其5年生存率小于10%。目前肝癌的治療手段主要以手術(shù)為主,化療、放療為輔,總體預(yù)后不良,因此需要尋找一種更加有效的輔助治療方法,從而提高肝癌的治療效果。在中國(guó)約80%的肝癌患者有乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染史,這在很大程度上反映了慢性HBV感染與HCC患病的關(guān)系。由病毒性肝炎和肝硬化最終發(fā)展為肝癌是肝癌形成的重要過程,然而只有一部分慢性HBV攜帶者發(fā)生肝癌,表明宿主遺傳因素也可能參與HCC的發(fā)病過程。DNA損傷后,細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的缺失可以作為肝癌發(fā)生的標(biāo)志。有研究結(jié)果顯示DNA雙鏈斷裂可使HBV的整合率明顯提高,從而促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。NBS1基因作為一種重要的DNA雙鏈修復(fù)相關(guān)基因,對(duì)維持基因組穩(wěn)定性及防止細(xì)胞癌變具有非常關(guān)鍵的作用,在維持端粒穩(wěn)定、開啟免疫球蛋白及減數(shù)分裂重組、促進(jìn)胚胎發(fā)育等發(fā)面也發(fā)揮了重要作用。流行病學(xué)資料顯示,NBS1缺失的雜合子可能不會(huì)出現(xiàn)相關(guān)臨床癥狀,但患者發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)仍有明顯增高,尤其是乳腺癌、前列腺癌、直腸癌、白血病及非霍奇金淋巴瘤等,但尚無研究明確證明其與肝癌發(fā)生有相關(guān)性。NBS1基因突變可促進(jìn)小鼠肝癌的發(fā)生,多個(gè)NBS1單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)位點(diǎn)可以增加患某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。NBS1SNP在HBV相關(guān)HCC中無大宗病例報(bào)道,基因調(diào)控機(jī)制的研究也較少。本文在之前報(bào)導(dǎo)的基礎(chǔ)上,首先做了 NBS1基因多態(tài)性與慢性HBV感染引起的HCC的相關(guān)性分析,然后運(yùn)用Meta分析的方法作系統(tǒng)綜述,進(jìn)一步明確陽性位點(diǎn)rs1805794C/G多態(tài)性與各種癌癥易感性的關(guān)系,最后,我們探究基因調(diào)控對(duì)肝癌細(xì)胞功能的影響機(jī)制。方法:從我院(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院)就診的患者及體檢的健康人群中隨機(jī)選取508例HBV感染相關(guān)的HCC患者作為試驗(yàn)組;另外選取481例性別與年齡相匹配的HBV感染患者以及581例未被HBV感染的健康人作為對(duì)照組。根據(jù)相關(guān)選點(diǎn)原則,從先前的全基因組相關(guān)研究(GWAS)和NBS1候選基因關(guān)聯(lián)研究中選取若干個(gè)SNP位點(diǎn)。收集全血標(biāo)本提取基因組DNA,并用Taqman法進(jìn)行基因分型。采用雙側(cè)卡方檢驗(yàn)評(píng)估患者和對(duì)照組在年齡、性別、吸煙和飲酒狀況分布上的差異,P0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著值。利用Plink軟件、Cochran-Armitage趨勢(shì)測(cè)試分析每組的基因型-表型關(guān)聯(lián)。對(duì)多個(gè)SNP位點(diǎn)測(cè)試進(jìn)行Bonferroni校正,P0.0125被認(rèn)為有顯著關(guān)聯(lián)性。為了進(jìn)一步明確rs1805794C/G多態(tài)位點(diǎn)與癌癥易感性的關(guān)系,我們運(yùn)用Meta分析的方法對(duì)相關(guān)研究作出了系統(tǒng)的綜述。研究中檢索了 2008年至2018年間在Pubmed及Embase公開發(fā)表的關(guān)于NBS1 rs1805794與癌癥易感性相關(guān)的臨床研究,對(duì)納入文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。用優(yōu)勢(shì)比(OR)和相對(duì)應(yīng)的95%可信區(qū)間(95%CI)來評(píng)價(jià)NBS1rs1805794C/G多態(tài)性與癌癥的關(guān)聯(lián)性強(qiáng)度。按照種族、對(duì)照組來源及癌癥種類進(jìn)行亞組分類,以評(píng)價(jià)這些因素對(duì)關(guān)聯(lián)分析的影響。最后,評(píng)估敏感性和發(fā)表偏倚。采用不同濃度NBS1-siRNA對(duì)HepG2細(xì)胞作用不同時(shí)間,檢測(cè)NBS1基因表達(dá)水平的變化,并利用CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染前、后細(xì)胞的增殖和凋亡水平。最后,利用PI單染色法結(jié)合流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期情況。用中濃度的siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞抑制NBS1表達(dá),24 h或48 h后提取細(xì)胞內(nèi)總的mRNA,利用FluiDigm高通量基因分析儀對(duì)48個(gè)特定基因分別進(jìn)行定量檢測(cè),其中β-actin和GAPDH為內(nèi)參基因,根據(jù)|FoldChange|2.0,P0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。對(duì)上述兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有的差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論(Gene ontology,GO)分析(P0.05),主要針對(duì)GO_BP進(jìn)行分析。認(rèn)為P值越小,該條GO Term越有意義,選取排在前10位的GO Term進(jìn)行分析;對(duì)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有的差異表達(dá)基因通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)進(jìn)行信號(hào)通路富集,根據(jù)P0.05的標(biāo)準(zhǔn)選取信號(hào)通路。結(jié)果:我們選取了五個(gè)可能導(dǎo)致肝癌的NBS1 SNPs,分別是rs10464867、rs1063053、rs1061302、rs1805794、rs709816。對(duì)參與者的全血 DNA 樣本進(jìn)行分析,其中四個(gè)位點(diǎn)(rs10464867、rs1063053,rs1805794、rs709816)被成功分型。我們發(fā)現(xiàn)這四個(gè)位點(diǎn)與HCC或慢性乙型肝炎的發(fā)病以及HBV的感染均無顯著相關(guān)性。值得注意的是,我們發(fā)現(xiàn)NBS1rsl805794C/G在HBV感染患者進(jìn)展成為HCC者中有重要作用(P=2.99E-03,OR=1.31)。經(jīng)過一系列的篩選,最終有21篇文獻(xiàn)(包含25個(gè)獨(dú)立研究)被納入我們的Meta分析,包括10901例癌癥病例及14124例對(duì)照。納入研究的對(duì)照組基因分型均符合H-W平衡,文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)分為6.5-8.5分�？傮w而言,攜帶C等位基因?qū)⒃黾踊及┑娘L(fēng)險(xiǎn)(Cvs.G:OR=1.21,95%CI:1.08-1.36,P=0.001)。亞組分析顯示攜帶C等位基因?qū)⒃黾踊几伟?OR=1.37,95%CI:1.13～1.67,P=0.001)、白血病(OR=1.77,95%CI:1.19～2.63,P=0.005)及鼻咽癌(OR=1.98,95%CI:1.76～2.24,P0.001)的風(fēng)險(xiǎn)。鼻咽癌的所有遺傳模型以及肝癌及白血病的大部分遺傳模型下,NBS1rs1805794C/G多態(tài)性與增加患癌風(fēng)險(xiǎn)存在顯著關(guān)聯(lián)性。亞洲人群rs1805794C/G多態(tài)性與癌癥風(fēng)險(xiǎn)的增加存在顯著關(guān)聯(lián)性,而在高加索人群的分析結(jié)果表明各基因型均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)照組為人群基礎(chǔ)(population-based,PB)來源的研究中rs1805794C/G與癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加存在顯著關(guān)聯(lián)性,而醫(yī)院基礎(chǔ)(hospital-based,HB)來源的研究中各基因型均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有遺傳模型的總體比較均發(fā)現(xiàn)顯著異質(zhì)性(P0.001),故采用隨機(jī)效應(yīng)模型。亞組分層分析后,乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、淋巴瘤、鼻咽癌、高加索人群,PB來源的研究中異質(zhì)性明顯降低,在大部分的基因模型中P0.1。在逐步排除每一項(xiàng)研究時(shí)并沒有觀察到OR值出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異性變化,結(jié)果驗(yàn)證了本Meta分析結(jié)果的穩(wěn)定性;Begg' s漏斗圖顯示納入的研究在各遺傳模型的圖形中分布基本對(duì)稱,呈倒置漏斗形,表明沒有發(fā)現(xiàn)明顯的發(fā)表偏倚。轉(zhuǎn)染不同濃度NBS1-siRNA的HepG2細(xì)胞與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力明顯減弱(P0.05或P0.01)。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,細(xì)胞增殖率較未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞即有所降低,但無明顯差異(P0.05);隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間增加,細(xì)胞增殖率急劇下降,當(dāng)轉(zhuǎn)染時(shí)間在48小時(shí)的時(shí)候增殖率下降最為顯著;在轉(zhuǎn)染72小時(shí)后,細(xì)胞增殖能力仍比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞有顯著降低,但相比48小時(shí)后的轉(zhuǎn)染率相差不大。綜合來看,當(dāng)用50nMsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)細(xì)胞的增值率最低,且在48小時(shí)后效果最為顯著。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞分析法觀察siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞凋亡情況。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,細(xì)胞凋亡的比率在轉(zhuǎn)染后明顯升高(P0.05或P0.01),并隨濃度增加而更為顯著。用中、高濃度的siRNA干擾NBS1表達(dá)后,HepG2細(xì)胞在S期的比例增加(P0.05)。結(jié)合上述siRNA可以抑制細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測(cè)干擾NBS1的表達(dá)可以通過使細(xì)胞在S期發(fā)生阻滯而抑制細(xì)胞繼續(xù)增殖。與對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后共有14個(gè)基因表達(dá)量上調(diào),7個(gè)基因表達(dá)下調(diào);而在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,共有15個(gè)基因表達(dá)上調(diào),5個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。通過聚類圖顯示2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異基因存在不同,韋恩圖結(jié)果顯示兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有的差異表達(dá)基因?yàn)?1個(gè),其中8個(gè)基因表達(dá)上調(diào),包括IRS1、MET、CCND1、IFG2、PTK2、YAP1、MYC、PTEN;3 個(gè)基因表達(dá)下調(diào),分別為 CDH13、TGFB1、AKT1。這些基因可能作為NBS1作用的下游靶點(diǎn),調(diào)控肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。GO分析可知干擾NBS1后的差異表達(dá)基因除了影響基本的細(xì)胞生命活動(dòng)功能,主要還可以調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移等;而KEGG結(jié)果顯示差異基因主要參與調(diào)控的信號(hào)通路包括癌癥通路、前列腺癌及結(jié)直腸癌等信號(hào)通路。結(jié)論:NBS1基因的rs1 805794 C/G多態(tài)性在HBV感染者中增加了患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn),很可能是中國(guó)漢族人群慢性HBV感染者患肝細(xì)胞癌的遺傳易感性因素。2.通過Meta分析,我們知道rs1 805794 C/G多態(tài)性可能對(duì)增加癌癥的易感性有至關(guān)重要的影響,尤其在肝癌、白血病及鼻咽癌病種及亞洲人群中。3.干擾NBS1在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)可以使細(xì)胞周期停滯在S期,抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡,通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析,我們對(duì)NBS1下游調(diào)控的靶點(diǎn)基因及通路有了初步的了解。意義:1.研究了中國(guó)漢族人群中NBS1 SNPs與HBV相關(guān)HCC易感性的關(guān)系。2.進(jìn)一步系統(tǒng)綜述了不同種族群體中NBS1 rs1805794 C/G多態(tài)性與包括肝癌在內(nèi)的各種癌癥易感性的關(guān)系。3.研究了NBS1基因?qū)epG2生物學(xué)功能的影響,并初步探究基因調(diào)控對(duì)肝癌細(xì)胞功能的影響機(jī)制。4.通過研究將有助于從基因突變及信號(hào)通路等角度研究HCC的發(fā)病機(jī)制,也為伴有NBS1突變和表達(dá)異常的HCC進(jìn)行早期診斷和靶向治療提供理論依據(jù)。
【圖文】：

山東大學(xué)博士學(xué)位論文ｋｈｅａｄ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ＦＨＡ）結(jié)構(gòu)域（２４－１０８?jìng)�(gè)氨基酸）和腫瘤抑制基端（ＢＲＣＴ）結(jié)構(gòu)域（１０８－１９６個(gè)氨基酸）；中央?yún)^(qū)域含有若干個(gè)ＳＱ基ＴＲ激酶識(shí)別的a愃嶧壞悖�；Ｃ－端含有Ｍ}澹歟旖岷嫌頡ｅ義希停遙耍懾宀峰澹瑁椋睿洌椋睿輳殄義，

本文編號(hào)：2702502