【摘要】：研究目的隱球菌性腦膜炎是預(yù)后十分兇險的深部真菌感染,它好發(fā)于免疫缺陷人群,若不積極治療,死亡率高。兩性霉素B(簡稱AMB)是國內(nèi)外治療指南中治療隱球菌性腦膜的首選用藥,但因為其副作用多且嚴(yán)重,難以透過血腦屏障,使隱腦治療效果下降。鞘內(nèi)給藥能提高腦脊液中AMB的濃度,但神經(jīng)毒性較大,而且需要反復(fù)腰穿,難以達(dá)到理想的藥代動力學(xué)水平,對疾病控制不利。PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物是一種可注射性智能型水凝膠,生物兼容性良好,在低于體溫時是液態(tài),能夠包載藥物,達(dá)到體溫時變?yōu)槟z狀態(tài),能夠緩慢控制釋放藥物。本實驗用PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物來負(fù)載AMB,并進(jìn)行鞘內(nèi)注射,使AMB在腦脊液中得到緩慢釋放,減少給藥次數(shù),減輕AMB的毒副作用,解決隱球菌腦膜炎目前的治療困境。研究方法第一部分,AMB凝膠的獲取和相關(guān)性質(zhì)檢測。我們首先合成了PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物,用核磁共振和凝膠滲透色譜儀確定該聚合物的分子結(jié)構(gòu)和并對其性能進(jìn)行表征。用生理鹽水將聚合物溶解成不同濃度的聚合物水溶液,測定其凝膠化溫度,根據(jù)結(jié)果選擇合適的濃度的聚合物水溶液進(jìn)行后續(xù)研究;用物理載藥方法將聚合物AMB負(fù)載于聚合物水溶液中(簡稱AMB凝膠),并對載藥前后的聚合物水溶液進(jìn)行流體力學(xué)檢測,以判斷AMB對該水凝膠是否有影響。第二部分,AMB凝膠的體外實驗。配制2 mg/mL、4 mg/mL和8 mg/mL三個濃度的AMB凝膠,置于緩釋液中,定時更換緩釋液,測定AMB凝膠體外緩釋度,繪制體外釋放曲線,計算累計釋放度,用藥物緩釋曲線中的一階方程對緩釋數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。第三部分,AMB凝膠的體內(nèi)實驗。在毒理學(xué)研究方面,選取健康大鼠為實驗對象,將AMB凝膠、普通AMB、空白凝膠、生理鹽水分別進(jìn)行鞘內(nèi)注射,每天觀察每組大鼠給藥后的情況,用Tavlor’s評分評估四肢活動能力,記錄大鼠死亡或存活情況,在給藥后的第7天取做大鼠脊髓做HE染色觀察脊髓損傷程度,與以上三個指標(biāo)比較各組藥物對脊髓的神經(jīng)毒性。在藥效學(xué)研究方面,建立大鼠隱球菌腦膜炎模型,在建模后的第7天開始用AMB凝膠、普通AMB、空白凝膠進(jìn)行鞘內(nèi)注射,在造模后的第14天和第21天取腦脊液做腦脊液培養(yǎng)計數(shù)和乳膠凝集試驗,進(jìn)行治療效果的評價。結(jié)果第一部分,通過對三嵌段聚合物的結(jié)構(gòu)和性能表征,結(jié)果顯示該聚合物分平均分子量為1790-1500-1790,聚合物的結(jié)構(gòu)分布控制非常好,是理想的產(chǎn)物。其液體-凝膠轉(zhuǎn)變相溫度為34°C,25 wt%聚合物水溶液課用于醫(yī)用。載藥前后聚合物水溶液的流體力學(xué)行為不發(fā)生變化,說明AMB對該聚合物水溶液沒有影響。第二部分,體外緩釋結(jié)果表明AMB凝膠可以緩慢釋放AMB長達(dá)36天,2 mg/mL、4 mg/mL和8 mg/mL三個濃度的AMB凝膠累積釋放度分別為89.0%、77.1%、65.6%,AMB緩釋數(shù)據(jù)符合藥物緩釋的一階方程(R~20.95)。第三部分,在毒理學(xué)實驗中,AMB凝膠組大鼠四肢的Tavlor’s評分高于普通AMB(P0.05),AMB凝膠組大鼠的生存率明顯高于普通AMB(P0.05),HE染色結(jié)果顯示AMB凝膠的脊髓損傷程度較普通AMB輕,以上結(jié)果表明AMB凝膠的神經(jīng)毒性明顯低于普通AMB。在藥效學(xué)實驗中,腦脊液培養(yǎng)結(jié)果顯示AMB凝膠組大鼠腦脊液中菌體數(shù)量低于普通AMB組(P0.05),乳膠凝集試驗結(jié)果表明AMB凝膠組腦脊液隱球菌抗原滴度數(shù)低于普通AMB組(P0.05),這都說明AMB凝膠的治療效果優(yōu)于普通AMB。結(jié)論P(yáng)LGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物水溶液負(fù)載AMB所得到的AMB凝膠較普通AMB有較多優(yōu)勢。它能緩慢釋放AMB超過30天,體內(nèi)的抗菌效果優(yōu)于普通AMB制劑,此外它還能減輕鞘內(nèi)注射AMB的神經(jīng)毒性,減少鞘內(nèi)給藥次數(shù),是比較理想的治療隱球菌腦膜炎的藥物,同時也是一種很好的鞘內(nèi)緩控給藥的手段。隱球菌性腦膜炎作為模式疾病,為其它疾病的鞘內(nèi)緩控給藥提供借鑒意義。
【圖文】：

、實驗結(jié)果一）PLGA-PEG-PLGA 的基本性質(zhì)LGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物以聚乙二醇（PEG，分子量15LA和GA為單體原料，在Sn(Oct)2的催化作用下進(jìn)行開環(huán)聚由1H NMR測定，如圖1-1所示，聚合物中LA單位的甲基質(zhì)子EG單位的亞甲基質(zhì)子特征峰在3.60 ppm，GA單位中的亞甲基，LA單位的次甲基質(zhì)子特征峰在5.20 ppm，PEG 單位中靠近特征峰在4.31ppm。通過其1H NMR譜圖中的5.20, 4.80和3.6，可以計算得到所合成的三嵌段聚合物的Mn、LA/GA摩爾比1, 35]。表1-1概括了由1H NMR和GPC測定的聚合物的分子基本圖1-2所示，曲線呈單峰分布，分散度為1.28，說明三嵌段共非常好，是理想的產(chǎn)物。

圖1-2 PLGA PEG PLGA三嵌段聚合物的凝膠滲透色譜流變力學(xué)段聚合物水溶液的相圖示，采用倒管法測量不同濃度聚合物水溶液的相轉(zhuǎn)變溫。根據(jù)相圖我們可以發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，聚合物水體圖中的三個區(qū)域：先是流動的溶膠態(tài)（sol）, 再轉(zhuǎn)變?yōu)槭剂鲃踊虍a(chǎn)生了相分離變成sol（suspension）。由相圖我們轉(zhuǎn)變溫度、凝膠窗口高度以及體系的臨界凝膠濃度（CG體系的CGC約為12 wt%，凝膠窗口較寬且覆蓋了人體溫聚合物水溶液的相轉(zhuǎn)變溫度約為33.5 °C，表明其可應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R519.4

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本文編號：2702076