【摘要】：目的:血吸蟲感染后,蟲卵沉積于肝血竇,多種炎性細胞被募集到蟲卵周圍,參與炎癥反應(yīng)并釋放多種細胞因子,這些細胞因子在肝星狀細胞活化增殖和肝纖維化發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮了重要作用。HIPPO信號通路是由一系列保守的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成的激酶鏈,與細胞增殖、極化、轉(zhuǎn)分化和凋亡等過程密切相關(guān)。HIPPO信號可能通過影響肝非實質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)分化、增殖和凋亡,從而影響肝纖維化的發(fā)生和進展,而HIPPO信號通路在血吸蟲感染引起的肝臟纖維化發(fā)生發(fā)展的作用機制尚不清楚。本文擬研究血吸蟲感染后宿主肝臟HIPPO通路及其相關(guān)蛋白的變化,并通過抑制HIPPO的下游分子YAP(Yes-associated protein,Yes-相關(guān)蛋白),來研究HIPPO信號通路對血吸蟲感染小鼠肝纖維化進展的影響。方法:雌性8周齡BALB/c小鼠經(jīng)皮膚感染16條日本血吸蟲尾蚴。血吸蟲感染4、8和15周后分離小鼠肝星狀細胞,檢測肝星狀細胞HIPPO信號相關(guān)分子YAP的表達。在血吸蟲感染4周后開始尾靜脈注射VP(Verteporfin,維替泊芬),感染8周和10周后觀察抑制YAP后小鼠肝臟病變改善情況,并檢測肝臟中各促纖維化蛋白及其基因的表達。分離小鼠肝星狀細胞,檢測病變小鼠原代肝星狀細胞纖維化相關(guān)分子的表達水平及活化程度改變。為研究HIPPO信號在血吸蟲感染后肝巨噬細胞活化中的作用,我們分離了感染及YAP抑制劑干預(yù)后的小鼠肝枯否細胞,檢測了其活化相關(guān)分子的表達,并用感染血吸蟲的小鼠枯否細胞的培養(yǎng)上清培養(yǎng)肝星狀細胞觀察了肝巨噬細胞在體外對星狀細胞活化的影響。結(jié)果:血吸蟲感染6周后小鼠肝臟可見明顯的蟲卵肉芽腫。血吸蟲感染4周、8周和15周后,小鼠肝星狀細胞中HIPPO信號相關(guān)分子YAP的mRNA表達水平上升,且免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)YAP蛋白向星狀細胞核內(nèi)聚積。血吸蟲感染4周給予VP,可明顯改善小鼠肝纖維化程度,肝組織的a-SMA、Collagen-a(16)和TGF-b1表達降低,且肝星狀細胞的a-SMA、Collagen-a(16)和CTGF的表達水平也下降了。另外,我們發(fā)現(xiàn)YAP抑制劑可下調(diào)RAW264.7細胞的Arg1和CTGF的表達。抑制YAP還能使體外培養(yǎng)的原代Kupffer細胞的Arg1、CTGF和TGF-b的mRNA表達水平下降。為明確Kupffer細胞抑制YAP后對肝星狀細胞的影響,我們分別用感染小鼠和給予YAP抑制的感染小鼠的Kupffer細胞的上清培養(yǎng)人肝星狀細胞系LX-2。結(jié)果發(fā)現(xiàn),給予YAP抑制劑能減緩感染小鼠Kupffer細胞上清加劇肝星狀細胞活化的過程,表現(xiàn)為肝星狀細胞的a-SMA、Collagen1-a(16)和CTGF的表達水平下降。結(jié)論:血吸蟲感染后肝星狀細胞的YAP在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào),且向核聚集,說明血吸蟲感染后引起的肝纖維化伴隨著肝星狀細胞中HIPPO通路的抑制和YAP的激活。體內(nèi)抑制YAP會減輕血吸蟲感染小鼠肝纖維化,表明HIPPO通路會影響肝纖維化形成的過程。抑制YAP不僅會抑制肝星狀細胞本身的活化,還會抑制Kuppfer細胞趨向M2型極化,使促纖維化因子分泌減少。此外,血吸蟲感染小鼠Kupffer細胞能誘導(dǎo)肝星狀細胞的活化,而抑制Kupffer細胞的YAP后能緩解這一作用,提示HIPPO通路的激活不僅能直接抑制HSCs的活化,還能影響Kupffer細胞極化,從而影響HSCs的活化間接介導(dǎo)血吸蟲肝纖維化的形成。
【圖文】：

圖1.血吸蟲感染小鼠原代HSCs高表達YAP原代 HSCs 分離自血吸蟲感染 4W、8W 和 15W 小鼠。（A）HE 染色和 Masson 染色示日本血吸感染 8 周后小鼠肝臟蟲卵肉芽腫。標尺為 200 m。（B）日本血吸蟲感染后小鼠的 HSCs，實時定PCR 測量 YAP 的 mRNA。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，n=3（*P㩳0.05）。

圖 3. VP 能抑制 YAP 的表達但不影響日本血吸蟲卵量日本血吸蟲感染 4W 后，每 3 天給小鼠靜脈注射 VP，感染后 8W 或 10W 處死小鼠獲取肝組織原代 HSCs。（A）單位肝組織重量的血吸蟲卵計數(shù)代表日本血吸蟲感染程度及蟲卵沉積程度。數(shù)以均數(shù)±標準差表示，，n=9（*P㩳0.05）。（B）實時定量 PCR 測量肝組織中 YAP 的 mRNA。數(shù)據(jù)以數(shù)±標準差表示，n=6（*P㩳0.05）。（C,D）免疫熒光染色檢測 HSCs 中 YAP 的表達。左：YAP 用 FI抗 YAP 抗體標記，中間：DAPI 染細胞核，右：合并圖片。標尺為 10 m。用 ImageJ 軟件計算平單個肝星狀細胞中總 YAP 和細胞核中 YAP 的積分光密度。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，n=6（㩳0.05）。Fig 3. VPcan inhibit the expression of YAPwithout intervention of parasite burden.BALB/c mice were infected with S. japonicum, four weeks post-infection, mice were treated Verteporfin(VP) or vehicle every three days. Mice were sacrificed to harvest liver tissues and isoprimary HSCs at eight or ten weeks after infection. (A) The egg count per liver weight represented
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.2;R532.21

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本文編號：2698132