【摘要】：[目的]結(jié)核病(TB)是全球重大公共衛(wèi)生問題之一,可分為肺結(jié)核和肺外結(jié)核病,其中,脊柱結(jié)核(STB)是較為常見的肺外結(jié)核。無論何種結(jié)核病,均由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染宿主并在宿主內(nèi)復(fù)制、增殖而發(fā)病。從細(xì)胞水平而言,MTB感染宿主后可被巨噬細(xì)胞吞噬而清除,同時(shí),MTB也可在巨噬細(xì)胞內(nèi)長期存活,并在一定條件下復(fù)制、增殖而擴(kuò)散,最終導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)生,因此,巨噬細(xì)胞的吞噬、增殖及凋亡等直接影響機(jī)體對MTB的作用。然而,巨噬細(xì)胞與MTB的相互作用極其復(fù)雜,目前結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。近期的研究表明:微小RNA在結(jié)核病的發(fā)生中起重要的調(diào)節(jié)作用。我們前期結(jié)果及相關(guān)研究也表明miR-145在肺結(jié)核及結(jié)核性脊柱炎中可能發(fā)揮重要作用,但一個(gè)微小RNA具有多個(gè)潛在的靶基因,其具體的調(diào)控機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的深入研究。通過生物信息學(xué)軟件分析我們發(fā)現(xiàn),除HDAC11外,白細(xì)胞介素16(IL-16)可能也是miR-145-3p的一個(gè)預(yù)測靶基因,而IL-16可以通過多種途徑在結(jié)核病中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)功能。因此,我們推測:miR-145可能通過調(diào)節(jié)IL-16的表達(dá)而在結(jié)核病發(fā)病中發(fā)揮作用。本文擬通過細(xì)胞培養(yǎng)及其體外實(shí)驗(yàn)對這一假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。[方法]1.細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增及誘導(dǎo)分化:采用THP-1細(xì)胞系進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增,用含有160nM PMA的含少于5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)THP-1向巨噬細(xì)胞分化。通過細(xì)胞形態(tài)觀察、流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)分化細(xì)胞的表型。2.IL-16對巨噬細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡及吞噬功能的影響:分別用濃度為0 ng/ml(對照組)、10 ng/ml、100 ng/ml、150 ng/ml 的 IL-16 刺激巨噬細(xì)胞。分別應(yīng)用CCK8試劑盒檢測不同濃度IL-16刺激對分化后的THP-1細(xì)胞增殖的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度IL-16刺激巨噬細(xì)胞后細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及的對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。3.miR-145-3p對巨噬細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、及吞噬功能的影響:采用上述實(shí)驗(yàn)技術(shù),并通過功能獲得(GOF)及功能缺失(LOF)實(shí)驗(yàn)研究miR-145-3p過表達(dá)和低表達(dá)對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡的影響。4.miR-145-3p對IL-16的表達(dá)水平的影響:采用RT-PCR和Western-blot檢測miR-145-3p mimics 及 miR-145-3p inhibitor 對 IL-16 的表達(dá)水平的影響。5.應(yīng)用熒光素梅報(bào)告基因從實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證miR-145-3p與IL-16之間是否存在基因-靶基因關(guān)系。[結(jié)果]1.細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化鑒定結(jié)果:細(xì)胞長勢良好,誘導(dǎo)分化后細(xì)胞表型CD11陽性。2.IL-16對巨噬細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、及吞噬功能的影響:2.1.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果:不同濃度的IL-16刺激分化后的THP-1細(xì)胞,其細(xì)胞增殖情況與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果:IL-16濃度為0 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、150 ng/ml巨噬細(xì)胞處于M期細(xì)胞比例分別為5.4%、9.0%、9.3%、9.4%,與對照組相比顯示在IL-16刺激下促使分化后THP-1細(xì)胞進(jìn)入分裂期;巨噬細(xì)胞凋亡率分別為4.9%、27.6%、33.0%、34.3%,與對照組相比結(jié)果顯示IL-16可增加巨噬細(xì)胞凋亡率,并隨著IL-16濃度的升高其凋亡率逐漸升高。2.3.雞紅細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果:對照組、吞噬組及實(shí)驗(yàn)組吞噬率分別為0%、30%、32%。結(jié)果顯示IL-16并不影響巨噬細(xì)胞的吞噬能力。3.miR-145-3p對巨噬細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡功能的影響:3.1.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果:miR-145-3p mimics組及miR-145-3p inhibitor組巨噬細(xì)胞增殖情況與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果:對照組、miR-145-3p mimics組及miR-145-3p inhibitor組處于M期細(xì)胞比例分別為34.8%、46.1%、25.6%;對照組、miR-145-3p mimics組及miR-145-3p inhibitor組凋亡率分別為6.1%、7.4%、4.9%。miR-145-3p過表達(dá)后促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡,而miR-145-3p表達(dá)量下降后巨噬細(xì)胞的凋亡率降低;4.轉(zhuǎn)染不同濃度miR-145-3p mimics后空白對照組,2.5u1,5u1,10ul組的△△CT值分別為0.64,0.63,0.61,0.66;轉(zhuǎn)染miR-145-3p inhibitor后空白對照組,2.5ul,5ul,l0ul組的 △ △CT值分別為0.66、0.58、0.64、0.65。結(jié)果顯示IL-16基因的表達(dá)量與miR-145-3p無關(guān)。Western blot檢測結(jié)果顯示隨著轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimics濃度的升高IL-16表達(dá)量升高,反之IL-16表達(dá)量下降。5.熒光素酶報(bào)告基因:miR-145-3p與IL-16間無直接基因與靶基因關(guān)系。[結(jié)論]1、miR-145-3p的表達(dá)量升高可增加巨噬細(xì)胞的凋亡率,促進(jìn)巨噬細(xì)胞進(jìn)入M期參與脊柱結(jié)核病理過程。但其并不影響巨噬細(xì)胞的增殖功能。2、IL-16的濃度升高增加巨噬細(xì)胞的凋亡率,促進(jìn)巨噬細(xì)胞進(jìn)入M期參與脊柱結(jié)核病理過程。但其并不影響巨噬細(xì)胞的增殖及吞噬功能。3、蛋白表達(dá)水平顯示miR-145-3p的變化與IL-16的表達(dá)變化一致。但miR-145-3p與IL-16間無直接的基因與靶基因關(guān)系,miR-145-3p可能通過某一旁路調(diào)控IL-16的表達(dá),但該結(jié)論有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。綜上所述,miR-145-3p、IL-16的表達(dá)通過影響巨噬細(xì)胞凋亡及其細(xì)胞周期,在結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染的免疫過程中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

圖３），細(xì)胞培養(yǎng)效果良好

符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)逡逑流式細(xì)胞儀結(jié)果（圖４）顯示陰性對照組、未分化染色組及誘導(dǎo)分化染色組逡逑的ＣＤｌｌｂ陽性率分別為１．２％，２１．７％，６２．０％。結(jié)果顯示分化效果較好，符合實(shí)逡逑驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。逡逑未誘導(dǎo)分化未ＣＤｌｌｂ染色邐未誘導(dǎo)分化ＣＤｌｌｂ染色逡逑Ａ０１邋ＴＨＰ－１邋ＮＣ邐Ｆ0２逡逑ｇ邋ＧｉｔｐｏＧＭ邐邋ｓ邋Ｇａ＾ｅ－Ｓｏ邋Ｇａｔｉｎｇ］逡逑＾邐丫邋１２§邐跟％逡逑§＿邐§－逡逑ｌ：；ｊ邐１：：邐１，逡逑°邐ｍ邋丨丨■丨丨⑴丨邋Ｍ邋ｉ邋⑴丨ｌ＿邋Ｉ邐°邐１１邋ｌｌｌｌ邋
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R529.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2697535