本文關(guān)鍵詞：重組腺病毒Ad-Dectin-1轉(zhuǎn)染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞及其在煙曲霉感染中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著免疫抑制人群的增加,侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis, IA)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。近年來(lái),宿主天然免疫在抗真菌感染中的作用和機(jī)制受到了廣泛重視。模式識(shí)別作用是抗真菌天然免疫的始動(dòng)環(huán)節(jié),而模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)是天然免疫應(yīng)答的始動(dòng)點(diǎn)。通過(guò)調(diào)節(jié)PRRs的表達(dá),干預(yù)宿主天然免疫狀態(tài),成為曲霉防治的突破點(diǎn)。樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-1 (dendritic cell-associated C-type lectin-1, Dectin-1)是重要的PRRs,通過(guò)識(shí)別真菌細(xì)胞壁的β-1,3葡聚糖,在抗真菌免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。既往研究表明,巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中添加Dectin-1胞外區(qū)蛋白能顯著增強(qiáng)其殺滅曲霉的能力。小鼠體內(nèi)試驗(yàn)也提示,經(jīng)尾靜脈注射表達(dá)Dectin-1胞外區(qū)蛋白的重組腺病毒能提高小鼠煙曲霉感染生存率。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages, AMs)是下呼吸道抵御病原微生物入侵的第一道防線,通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞和非特異性吞噬作用清除曲霉孢子,釋放多種細(xì)胞因子,募集并激活中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等其它免疫細(xì)胞至感染部位,并能調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子的平衡,協(xié)同抗曲霉炎癥反應(yīng)。本研究擬構(gòu)建表達(dá)Dectin-1基因的重組腺病毒(Adenovirus, Ad),并使其攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)標(biāo)記,通過(guò)轉(zhuǎn)染AMs,建立Dectin-1高表達(dá)的細(xì)胞模型,觀察煙曲霉感染過(guò)程中,Dectin-1高表達(dá)對(duì)AMs天然免疫防御功能的調(diào)節(jié)作用。第一部分重組腺病毒Ad-Dectin-1的構(gòu)建及鑒定目的：構(gòu)建表達(dá)小鼠Dectin-1基因的重組腺病毒Ad-Dectinn-1,擴(kuò)增、純化獲得高濃度的重組腺病毒。材料與方法：構(gòu)建Dectin-1-pIRES2-EGFP重組質(zhì)粒,以該質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增目的片段,將目的片段重組到中間載體pDONR221上,再與腺病毒骨架質(zhì)粒pAD/CMV/V5-DEST重組,獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAD-Dectin-1-pIRES2-EGFP,經(jīng)Pac Ⅰ線性化后轉(zhuǎn)染人胚腎293 (human embryo kidney, HEK293)細(xì)胞,收獲重組腺病毒Ad-Dectin-1,利用HEK293細(xì)胞大量擴(kuò)增腺病毒,濃縮和純化收獲高濃度腺病毒。Real-time PCR法檢測(cè)Dectin-1基因mRNA表達(dá)量,半數(shù)組織細(xì)胞感染(tissue culture infective dose, TCID50)法測(cè)定腺病毒滴度。結(jié)果：經(jīng)酶切和菌落PCR鑒定證實(shí)重組腺病毒含有目的基因Dectin-1, Real-timePCR檢測(cè)到Dectin-1表達(dá)量是空病毒對(duì)照組的8677倍,TCID50法測(cè)得濃縮和純化后的重組腺病毒滴度為5×1011IU/ml。結(jié)論：成功構(gòu)建了表達(dá)目的基因Dectin-1的重組腺病毒Ad-Dectin-1,并獲得了較高的腺病毒滴度。第二部分重組腺病毒Ad-Dectin-1轉(zhuǎn)染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞目的：重組腺病毒Ad-Dectin-1體外轉(zhuǎn)染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S,構(gòu)建Dectin-1高表達(dá)的細(xì)胞模型。材料與方法：重組腺病毒Ad-Dectin-1體外轉(zhuǎn)染MH-S細(xì)胞(Ad-Dectin-1-EGFP組),熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,確定轉(zhuǎn)染的最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)值。Real-time PCR法檢測(cè)Dectin-1基因mRNA表達(dá)量,Western blot檢測(cè)Dectin-1蛋白表達(dá)量,激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面Dectin-1表達(dá)情況。同時(shí)設(shè)不轉(zhuǎn)染腺病毒的MH-S細(xì)胞為空白對(duì)照,轉(zhuǎn)染空病毒的MH-S細(xì)胞為陰性對(duì)照(Ad-EGFP組)。結(jié)果：重組腺病毒轉(zhuǎn)染MH-S細(xì)胞12h即可見(jiàn)少量綠色熒光表達(dá),48 h熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值,MOI值為2200時(shí)細(xì)胞增值率下降,轉(zhuǎn)染最佳MOI值為1800。Real-timePCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Dectin-1基因mRNA和蛋白表達(dá)量均較Ad-EGFP組顯著增加。激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí),細(xì)胞膜表面有Dectin-1表達(dá),且表達(dá)量較Ad-EGFP組顯著增加。結(jié)論：重組腺病毒Ad-Dectin-1可在體外轉(zhuǎn)染MH-S細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后Dectin-1基因mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加,Dectin-1高表達(dá)的細(xì)胞模型構(gòu)建成功。第三部分Dectin-1高表達(dá)的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞在煙曲霉感染中的作用目的：探討Dectin-1高表達(dá)對(duì)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞抗煙曲霉感染能力的影響。材料與方法：通過(guò)轉(zhuǎn)染重組腺病毒Ad-Dectin-1構(gòu)建Dectin-1高表達(dá)的MH-S細(xì)胞模型,用煙曲霉孢子感染,Real-time PCR檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10mRNA的表達(dá)量,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-10的量,平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算MH-S細(xì)胞對(duì)煙曲霉孢子的殺滅百分?jǐn)?shù)。結(jié)果：Real-time PCR和ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明,Dectin-1高表達(dá)的MH-S細(xì)胞在受到煙曲霉孢子刺激時(shí),炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10的表達(dá)量增加。平板菌落計(jì)數(shù)法結(jié)果顯示,Dectin-1高表達(dá)的MH-S細(xì)胞對(duì)孢子的殺滅百分?jǐn)?shù)顯著高于對(duì)照組。結(jié)論：在煙曲霉感染過(guò)程中,Decetin-1高表達(dá)的MH-S細(xì)胞炎癥因子表達(dá)量增加,對(duì)煙曲霉孢子的殺滅能力增強(qiáng),提示Dectin-1高表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)天然免疫反應(yīng)提高宿主抵抗曲霉感染的能力。
【關(guān)鍵詞】：重組腺病毒 Dectin-1 肺泡巨噬細(xì)胞 煙曲霉 天然免疫 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R519.8
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-18
• 參考文獻(xiàn)15-18
• 第一部分 重組腺病毒Ad-Dectin-1的構(gòu)建及鑒定18-34
• 引言18
• 材料與方法18-25
• 結(jié)果25-30
• 討論30-31
• 小結(jié)31-32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 第二部分 重組腺病毒Ad-Dectin-1轉(zhuǎn)染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞34-46
• 引言34
• 材料與方法34-39
• 結(jié)果39-43
• 討論43
• 小結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-46
• 第三部分 Dectin-1高表達(dá)的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞在煙曲霉感染中的作用46-58
• 引言46
• 材料與方法46-50
• 結(jié)果50-54
• 討論54-55
• 小結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-58
• 全文總結(jié)58-59
• 文獻(xiàn)綜述59-65
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 碩士期間發(fā)表論文65-66
• 致謝66-67

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