【摘要】：研究意義目前,結(jié)核病(Tuberculosis,TB)仍然是世界范圍內(nèi)的一個重大公共衛(wèi)生問題。TB是全球死亡人數(shù)最多的傳染病,其病原菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)細(xì)胞壁厚、通透性差,并且它主要寄生在巨噬細(xì)胞(Mф)內(nèi),導(dǎo)致藥物難以滲透MTB的雙重障礙而耐藥,TB的控制依然面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn),臨床上迫切需要尋找新的抗結(jié)核感染治療新方法,為此,本文研究了LFLIU聯(lián)合載左氧氟沙星PLGA納米粒對巨噬細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis,MS)的生物學(xué)效應(yīng)和殺菌機制,有望為結(jié)核病的治療提供一種無創(chuàng)、安全、有效的方法。目的探討LFLIU聯(lián)合載藥PLGA納米粒突破Mф、MTB細(xì)胞壁雙層屏障的殺菌效果及機制,有望顯著縮短結(jié)核病化療療程,為陷入困境的結(jié)核病治療帶來新突破。方法1.LFLIU對巨噬細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌的損傷效應(yīng):選用頻率為42KHz,換能器直徑45mm,輸出聲強范圍0.13~0.34 W/cm~2連續(xù)可調(diào)的超聲波發(fā)射儀。分別用聲強0.14 W/cm~2、0.33 W/cm~2的超聲輻照巨噬細(xì)胞RAW264.7 0、5、10 min和15 min,篩選出對巨噬細(xì)胞活性無明顯影響的超聲輻照劑量。(1)建立恥垢分枝桿菌感染RAW264.7細(xì)胞吞噬模型,用聲強0.14 W/cm~2的超聲分別輻照該感染細(xì)胞0、5、10 min。(2)選用正常RAW264.7細(xì)胞,用聲強0.14 W/cm~2的超聲分別輻照0、5、10 min。實驗后,分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞的凋亡率和壞死率,使用平板計數(shù)法評估RAW264.7細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌的活性,使用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察并定量RAW264.7細(xì)胞經(jīng)超聲輻照后產(chǎn)生的活性氧。2.LFLIU聯(lián)合載左氧氟沙星PLGA納米粒對巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)恥垢分枝桿菌的殺菌作用和機制:(1)采用雙乳化法制備載左氧氟沙星PLGA納米粒,利用馬爾文激光粒度儀檢測該納米粒的粒徑,電位和多分散性;在電鏡下觀察它的形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu);測量載藥納米粒72h內(nèi)藥物自然釋放率及一定超聲輻照后藥物的釋放率;比較游離左氧氟沙星和載左氧氟沙星納米粒分別對RAW264.7細(xì)胞的毒性作用。(2)將被感染恥垢分枝桿菌的巨噬細(xì)胞分為6個組(N=3):對照組、游離左氧氟沙星組、載左氧氟沙星納米粒組、單獨超聲輻照組、超聲聯(lián)合游離左氧氟沙星組、超聲聯(lián)合載左氧氟沙星納米粒組。實驗后,用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察和檢測LFLIU對載左氧氟沙星納米粒的吞噬情況以及細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧,同時用流式細(xì)胞儀分析被處理后的RAW264.7細(xì)胞的壞死率和凋亡率,用透射電鏡觀察巨噬細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌的結(jié)構(gòu)變化,通過菌落計數(shù)法評估RAW264.7細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌的存活情況。結(jié)果1.成功制備了物理特性好的載左氧氟沙星PLGA納米粒:(1)掃描電鏡下觀察呈球形,形態(tài)均一、分散性良好,透射電鏡下可見藥物被包封于PLGA納米粒內(nèi)部。(2)納米粒性能穩(wěn)定,Zata電位為-20.8±4.25mV,粒徑較小,僅為229.8±?12.1nm,載藥率和包封率分別是(8.36?±?0.74)%、(84.74?±?1.28)%。(3)連續(xù)監(jiān)測了72h內(nèi)載藥納米粒內(nèi)藥物的釋放,72h后,超聲處理組約有74%的左氧氟沙星被釋放出來,對于未經(jīng)超聲處理的自然釋放組,大約只有39%的藥物被釋放,結(jié)果表明超聲可誘導(dǎo)納米粒內(nèi)左氧氟沙星的釋放。(4)PLGA納米粒內(nèi)藥物濃度在一定范圍內(nèi)時,對巨噬細(xì)胞無細(xì)胞毒性。2.一定劑量的LFLIU對巨噬細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌的損傷效果顯著:用不同聲強和時間輻照巨噬細(xì)胞及吞噬模型,結(jié)果提示:(1)用聲強0.33 W/cm~2的LILIU輻照巨噬細(xì)胞5、10、15min以及用聲強0.14W/cm~2的LFLIU輻照巨噬細(xì)胞15 min時,巨噬細(xì)胞的存活率低于75%,影響巨噬細(xì)胞的活性,當(dāng)超聲強度為0.14 W/cm~2,輻照時間為5、10 min時,對巨噬細(xì)胞的生長活性影響較小,此時巨噬細(xì)胞存活率分別為(116.37±9.54)%,(97.14±9.26)%。(2)用聲強0.14 W/cm~2的超聲輻照RAW264.7細(xì)胞10 min時,恥垢分枝桿菌的吞噬率達(dá)到了58.55%,而假照組吞噬率為32.47%,表明LFLIU可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞對恥垢分枝桿菌的吞噬。(3)當(dāng)RAW264.7細(xì)胞感染恥垢分枝桿菌后,用聲強0.14W/cm~2的LFLIU輻照5 min,細(xì)胞凋亡率和壞死率高于超聲輻照0 min(P0.01),但LFLIU輻照10min時,細(xì)胞凋亡率和壞死率未進(jìn)一步增加。(4)用聲強0.14 W/cm~2的LFLIU輻照10 min時,RAW264.7細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度高于超聲輻照5 min(P0.01),結(jié)果提示隨著LFLIU輻照時間的增加,細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度增加。(5)用聲強0.14 W/cm~2的LFLIU輻照0、5、10min后,RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的恥垢分枝桿菌活菌數(shù)分別為(4.64±0.21)×10~5 CFU/mL,(3.73±0.21)×10~5,(2.20±0.21)×10~5 CFU/mL,表明RAW264.7細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌菌活力隨著LFLIU輻照時間的增加而降低,最佳LFLIU輻照劑量為聲強0.14 W/cm~2,輻照時間10min。3.LFLIU協(xié)同載左氧氟沙星PLGA納米粒對巨噬細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌的殺菌效果顯著:(1)聲強0.14 W/cm~2LFLIU處理10min后,巨噬細(xì)胞對納米粒的吞噬率為54.86±7.45%,假照組的吞噬率為33.18±4.16%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),表明LFLIU能促進(jìn)巨噬細(xì)胞對納米粒的吞噬。(2)LFLIU聯(lián)合載左氧氟沙星PLGA納米�？娠@著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,超聲聯(lián)合載藥納米粒,活性氧熒光強度達(dá)到了1844.3±46.7,約為對照組(993.9±47.5)的兩倍。(3)與對照組相比,超聲聯(lián)合載藥納米粒的凋亡率為(21.25±1.15)%,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),提示超聲聯(lián)合載左氧氟沙星納米粒促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡。(4)一定劑量的LFLIU聯(lián)合載左氧氟沙星納米粒可對RAW264.7細(xì)胞自身產(chǎn)生損傷效應(yīng),透射電鏡下觀察到超聲處理后,巨噬細(xì)胞部分微絨毛消失,細(xì)胞核體積減小、染色質(zhì)濃縮,巨噬細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌受到嚴(yán)重?fù)p傷,恥垢分枝桿菌壁破裂,結(jié)構(gòu)不完整,脂滴和糖原含量增加。(5)LFLIU聯(lián)合載左氧氟沙星PLGA納米粒對巨噬細(xì)胞內(nèi)的恥垢分枝桿菌的殺菌率為82.2%,顯示出高于對照組(不用藥物處理,也不用超聲處理)10倍的抗菌活性。結(jié)論1.一定劑量的LFLIU可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞對恥垢分枝桿菌的吞噬作用,單獨超聲可損傷巨噬細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌。2.LFLIU聯(lián)合載左氧氟沙星PLGA納米粒對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌的增效殺菌作用顯著。
【圖文】：

圖 3 LFLIU 對 RAW264.7 細(xì)胞凋亡和壞死的影響Fig. 3 Effect of LFLIU on apoptosis and necrosis of RAW264.7 cells表 2 RAW264.7 細(xì)胞凋亡率和壞死率（ , %）Tab. 2 Apoptotic and necrotic rates of RAW264.7 (%)聲強（0.14 W/cm2）輻照時間（min）0 5 10加入 MS菌凋亡率 7.37±1.76 18.34±1.28b5.10±0.46壞死率 6.51±1.08 17.90±1.48b5.47±1.37無 MS 菌加入凋亡率 4.75±0.98 12.96±0.75b2.38±1.42壞死率 1.26±0.27 5.70±0.41b3.26±1.57a

圖 4 LFLIU 對 RAW264.7 細(xì)胞內(nèi) MS 的活力影響Fig. 4 The effect of LFLIU on the activity of MS in RAW264.7 cells LFLIU 刺激 RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生活性氧流式細(xì)胞術(shù)分析活性氧水平的變化，結(jié)果顯示熒光曲線向右位移（圖 5），表聲輻照 10 min 組 RAW264.7 細(xì)胞內(nèi) ROS 濃度高于超聲輻照 5 min 組。用激光焦顯微鏡觀察 RAW264.7 細(xì)胞內(nèi) ROS 的水平（圖 6），結(jié)果顯示隨著超聲輻間的增加，ROS 濃度增加，，這和流式細(xì)胞儀測得的定量結(jié)果是相同的。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R52

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本文編號：2689126