【摘要】：近年來,干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome,SS)作為一種常見的自身免疫性疾病,其復雜的致病機制和發(fā)病過程已引起眾多研究者的重視。雖然全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study,GWAS)報道了與疾病相關(guān)的易感基因,也有多個遺傳學關(guān)聯(lián)研究闡明不同的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide ploymorphism,SNP)與疾病的關(guān)聯(lián)性,同時研究者們已鑒定出干擾素(Interferon,IFN)信號通路相關(guān)基因從遺傳學水平和分子免疫學水平對疾病的發(fā)生進行調(diào)控,但是干燥綜合征的具體發(fā)病機制仍不明確,進而阻礙了臨床治療和藥物研發(fā)的進展。因此,對干燥綜合征發(fā)病機制的研究具有重要意義。本課題組長期收集中國漢族干燥綜合征樣本,本研究共使用1455例健康對照和588例疾病人群,我們從全血樣本中提取基因組DNA以及分離外周血單核細胞(PBMC),根據(jù)實驗需要提取PBMC m RNA或構(gòu)建永生化B淋巴母細胞系。首先我們通過遺傳學技術(shù)鑒定了OAS1(2'-5'-oligoadenylate synthetase 1)基因功能性位點rs10774671與中國漢族干燥綜合征的遺傳關(guān)聯(lián)性,發(fā)現(xiàn)該位點與干燥綜合征具有遺傳關(guān)聯(lián)作用(P=0.0398,odds ratio/OR=0.85);接下來我們整合了患者的抗SSA抗體信息,用統(tǒng)計學方法分析后發(fā)現(xiàn)rs10774671與抗SSA抗體陽性的干燥綜合征相關(guān)(P=8.0×10-5,OR=0.85),與抗SSA抗體陰性的干燥綜合征無關(guān)聯(lián)性(P=0.1725);同時,我們也整合了患者抗核心抗體(HBc)信息,發(fā)現(xiàn)該位點與抗SSA抗體陽性/抗HBc抗體陽性的干燥綜合征具有遺傳關(guān)聯(lián)(P=0.0059,OR=0.36),與抗SSA抗體陽性/抗HBc抗體陰性的干燥綜合征不相關(guān)(P=0.3746,OR=1.24)。OAS1是干擾素信號通路的重要因子,其5號內(nèi)含子上功能性SNP位點rs10774671與多種自身免疫病表現(xiàn)出相關(guān)性,包括多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)和I型糖尿病(Type 1 diabetes,T1D)。本研究結(jié)果首次鑒定出在中國漢族人群中OAS1基因位點rs10774671與干燥綜合征具有遺傳關(guān)聯(lián),這與同期報道的該位點在歐洲干燥綜合征人群中的遺傳關(guān)聯(lián)性相符,進一步驗證了OAS1在該病中的遺傳易感性;同時,rs10774671與抗SSA抗體陽性的干燥綜合征相關(guān),抗SSA抗體作為該病的自身反應性抗體,抗原SSA/Ro60被認為可以促進疾病的發(fā)生,此結(jié)果提示了OAS1與SSA/Ro60間可能存在潛在地協(xié)同致病關(guān)系。另外一組關(guān)聯(lián)分析數(shù)據(jù)表明rs10774671與抗SSA抗體陽性/抗HBc抗體陽性的干燥綜合征相關(guān),這一結(jié)果首次從遺傳學水平證明了OAS1與中國漢族干燥綜合征并發(fā)HBV病毒感染的遺傳關(guān)聯(lián),目前HBV感染在不同種族的干燥綜合征患者中表現(xiàn)出相異的關(guān)聯(lián)性,鑒于我國是HBV感染高發(fā)地區(qū),結(jié)合中國特殊的流行病學特征,明確中國人群中HBV感染與干燥綜合征發(fā)病的遺傳關(guān)聯(lián)作用和分子機制,具有重要的臨床意義。在明確rs10774671位點與疾病的遺傳關(guān)聯(lián)作用后,我們進一步鑒定了該位點與疾病樣本中OAS1基因表達的關(guān)系。首先我們分別在“G/G”、“G/A”、“A/A”基因型的對照組和疾病組樣本中檢測了總OAS1基因表達,發(fā)現(xiàn)無論在干燥綜合征患者還是正常健康人群中,rs10774671位點與總OAS1基因表達均無關(guān)聯(lián);但是將抗SSA抗體陽性患者與抗SSA抗體陰性患者相比,前者中總OAS1基因表達顯著增強。鑒于OAS1是干擾素調(diào)控的下游基因,我們還檢測了rs10774671與干燥綜合征患者的OAS1基因在受到干擾素刺激后表達變化之間的關(guān)系,結(jié)果證明二者無相關(guān)性。同時,我們通過生物信息數(shù)據(jù)庫分析,發(fā)現(xiàn)與rs10774671表現(xiàn)連鎖不平衡關(guān)系(r20.95)的SNP位點,部分分布在OAS3基因啟動子區(qū)域,為探究OAS3在干燥綜合征發(fā)病過程中發(fā)揮的作用,我們同樣檢測了rs10774671位點與對照組、疾病組和干擾素刺激的疾病樣本中總OAS3基因表達的關(guān)系,結(jié)果顯示該位點與OAS3基因表達沒有關(guān)聯(lián)。根據(jù)上述結(jié)論,rs10774671與疾病的發(fā)生具有顯著遺傳關(guān)聯(lián),然而基因表達數(shù)據(jù)表明該位點與總OAS1 m RNA表達無關(guān),為進一步闡述rs10774671位點基因型突變后的致病機制,我們檢測了四種OAS1蛋白亞型(Transcript variant,TV)在疾病樣本中的基因表達與基因型的關(guān)系。已知rs10774671位點上發(fā)生“G”到“A”突變后,m RNA剪切前體無法識別原有序列引起錯誤切割,因而形成三種新蛋白亞型(OAS1 TV2、TV3、TV4,對應野生型OAS1 TV1、)。我們根據(jù)各亞型序列特點,分別設計了特異性OAS1蛋白亞型引物序列,在三種基因型的疾病樣本中鑒定了各亞型的蛋白表達。結(jié)果表明在野生純合子樣本中,OAS1 TV1亞型基因表達增強,而在突變基因型樣本中,OAS1 TV2、TV3、TV4亞型表達增強。這一數(shù)據(jù)揭示了當SNP位點的等位基因發(fā)生變化時,機體表達出不同的OAS1蛋白亞型,結(jié)合新亞型應答免疫能力降低的現(xiàn)象,我們從分子生物學水平闡明rs10774671基因突變的人群更易罹患干燥綜合征。已知OAS1蛋白可以通過Jak-STAT信號通路抵抗HBV病毒的感染與復制活性,為深入探究本研究中rs10774671位點與HBV感染關(guān)聯(lián)的分子機制,我們分別構(gòu)建了四種OAS1亞型的表達載體,與HBV病毒表達載體共同轉(zhuǎn)染到肝細胞中,通過Western Blot、ELISA和熒光定量PCR的方法檢測細胞內(nèi)和上清中的HBc抗原的表達,發(fā)現(xiàn)OAS1 TV1亞型的抗病毒能力明顯強于其他三種亞型。因此,當rs10774671位點發(fā)生突變后,OAS1 TV1亞型蛋白表達降低,OAS1 TV2、TV3、TV4亞型表達增強,但是新亞型的抗病毒能力下降,這一結(jié)論揭示了攜帶突變基因“A”的人群更易感染HBV病毒。本研究首次鑒定了OSA1基因上功能性SNP位點rs10774671與中國漢族干燥綜合征并發(fā)HBV感染的遺傳關(guān)聯(lián),并驗證了rs10774671調(diào)控干燥綜合征發(fā)病和HBV感染的分子機制,有助于研究者們加強對于干燥綜合征易感基因和發(fā)病機制的認識,為推進疾病的治療奠定了基礎。
【圖文】：

致機體自身的免疫系統(tǒng)攻擊自體的健康組織和細胞，因而產(chǎn)生病變 1933 年首次被描述，目前在我國的發(fā)病率可達 0.77%，女性患病比例九倍[3, 4]，通常在女性中年時期發(fā)病。根據(jù)發(fā)病方式的不同，該病可分干燥綜合征（primary Sj gren’s syndrome，pSS）和繼發(fā)性干燥綜condarySj gren’ssyndrome，sSS），本文以原發(fā)性干燥綜合征為主展開討干燥綜合征的主要臨床癥狀為淋巴細胞侵潤淚腺、唾液腺等外分泌進而液的產(chǎn)生，臨床常見表現(xiàn)包括眼睛干燥（干眼癥或干燥性角膜結(jié)膜炎）燥癥（圖 1.1）[5]。干燥性角膜結(jié)膜炎通常在患者體內(nèi)潛伏數(shù)年；干眼癥發(fā)角膜潰瘍和眼瞼感染[6]。干燥綜合征導致的口腔干燥可能會影響患者，并且在夜間也需要頻繁的飲水，，同時唾液的保護和抗菌特性的喪失可齲齒產(chǎn)生進而促進患者罹患口腔念珠菌病、腮腺腫脹和其他干燥癥，如、皮膚和陰道的干燥。干燥綜合征患者臨床表現(xiàn)多樣化，輕重程度不一展嚴重時還會累積腎臟、肺和肝臟等器官，甚至威脅生命[7, 8]。

自身抗原蛋白（白色）結(jié)合雙鏈 Y RNA（紅色）和色）的末端。e Ro autoantigen protein (white) binds the end of a doubRNA (red) and a single stranded RNA (blue). PDB: 1YV缺陷分子的降解。SSA/Ro60還可以與細胞中的RNApstein-Barr 病毒（EBV）的早期 RNA1（EBER1），S出以抗核糖體和抗染色質(zhì)抗體以及腎小球腎炎為特 SSA/Ro60 可能在預防系統(tǒng)性自身免疫疾病中具有重Ro60 作為可提取核抗原家族的重要成員之一，具有在lupuserythematosus，SLE）或原發(fā)性干燥綜合征的患能力[15]，同時抗 SSA 自身抗體與這些疾病中的炎癥上述結(jié)果為基礎，研究者提出 SSA/Ro60 識別宿主內(nèi)[18
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R593.2;R512.62

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1 郝勇;彭博;吉木斯;趙一_g;楊美麗;韓慧;石繼海;;高球蛋白血癥性紫癜并發(fā)干燥綜合征1例[J];中國皮膚性病學雜志;2017年12期

2 李海珍;;以高球蛋白血癥性紫癜為主要表現(xiàn)的干燥綜合征1例[J];臨床皮膚科雜志;2018年03期

3 趙文甲;劉維;吳沅v

本文編號：2689291