【摘要】：近年來(lái),干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome,SS)作為一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病,其復(fù)雜的致病機(jī)制和發(fā)病過(guò)程已引起眾多研究者的重視。雖然全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study,GWAS)報(bào)道了與疾病相關(guān)的易感基因,也有多個(gè)遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)研究闡明不同的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide ploymorphism,SNP)與疾病的關(guān)聯(lián)性,同時(shí)研究者們已鑒定出干擾素(Interferon,IFN)信號(hào)通路相關(guān)基因從遺傳學(xué)水平和分子免疫學(xué)水平對(duì)疾病的發(fā)生進(jìn)行調(diào)控,但是干燥綜合征的具體發(fā)病機(jī)制仍不明確,進(jìn)而阻礙了臨床治療和藥物研發(fā)的進(jìn)展。因此,對(duì)干燥綜合征發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。本課題組長(zhǎng)期收集中國(guó)漢族干燥綜合征樣本,本研究共使用1455例健康對(duì)照和588例疾病人群,我們從全血樣本中提取基因組DNA以及分離外周血單核細(xì)胞(PBMC),根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要提取PBMC m RNA或構(gòu)建永生化B淋巴母細(xì)胞系。首先我們通過(guò)遺傳學(xué)技術(shù)鑒定了OAS1(2'-5'-oligoadenylate synthetase 1)基因功能性位點(diǎn)rs10774671與中國(guó)漢族干燥綜合征的遺傳關(guān)聯(lián)性,發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與干燥綜合征具有遺傳關(guān)聯(lián)作用(P=0.0398,odds ratio/OR=0.85);接下來(lái)我們整合了患者的抗SSA抗體信息,用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析后發(fā)現(xiàn)rs10774671與抗SSA抗體陽(yáng)性的干燥綜合征相關(guān)(P=8.0×10-5,OR=0.85),與抗SSA抗體陰性的干燥綜合征無(wú)關(guān)聯(lián)性(P=0.1725);同時(shí),我們也整合了患者抗核心抗體(HBc)信息,發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與抗SSA抗體陽(yáng)性/抗HBc抗體陽(yáng)性的干燥綜合征具有遺傳關(guān)聯(lián)(P=0.0059,OR=0.36),與抗SSA抗體陽(yáng)性/抗HBc抗體陰性的干燥綜合征不相關(guān)(P=0.3746,OR=1.24)。OAS1是干擾素信號(hào)通路的重要因子,其5號(hào)內(nèi)含子上功能性SNP位點(diǎn)rs10774671與多種自身免疫病表現(xiàn)出相關(guān)性,包括多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)和I型糖尿病(Type 1 diabetes,T1D)。本研究結(jié)果首次鑒定出在中國(guó)漢族人群中OAS1基因位點(diǎn)rs10774671與干燥綜合征具有遺傳關(guān)聯(lián),這與同期報(bào)道的該位點(diǎn)在歐洲干燥綜合征人群中的遺傳關(guān)聯(lián)性相符,進(jìn)一步驗(yàn)證了OAS1在該病中的遺傳易感性;同時(shí),rs10774671與抗SSA抗體陽(yáng)性的干燥綜合征相關(guān),抗SSA抗體作為該病的自身反應(yīng)性抗體,抗原SSA/Ro60被認(rèn)為可以促進(jìn)疾病的發(fā)生,此結(jié)果提示了OAS1與SSA/Ro60間可能存在潛在地協(xié)同致病關(guān)系。另外一組關(guān)聯(lián)分析數(shù)據(jù)表明rs10774671與抗SSA抗體陽(yáng)性/抗HBc抗體陽(yáng)性的干燥綜合征相關(guān),這一結(jié)果首次從遺傳學(xué)水平證明了OAS1與中國(guó)漢族干燥綜合征并發(fā)HBV病毒感染的遺傳關(guān)聯(lián),目前HBV感染在不同種族的干燥綜合征患者中表現(xiàn)出相異的關(guān)聯(lián)性,鑒于我國(guó)是HBV感染高發(fā)地區(qū),結(jié)合中國(guó)特殊的流行病學(xué)特征,明確中國(guó)人群中HBV感染與干燥綜合征發(fā)病的遺傳關(guān)聯(lián)作用和分子機(jī)制,具有重要的臨床意義。在明確rs10774671位點(diǎn)與疾病的遺傳關(guān)聯(lián)作用后,我們進(jìn)一步鑒定了該位點(diǎn)與疾病樣本中OAS1基因表達(dá)的關(guān)系。首先我們分別在“G/G”、“G/A”、“A/A”基因型的對(duì)照組和疾病組樣本中檢測(cè)了總OAS1基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)無(wú)論在干燥綜合征患者還是正常健康人群中,rs10774671位點(diǎn)與總OAS1基因表達(dá)均無(wú)關(guān)聯(lián);但是將抗SSA抗體陽(yáng)性患者與抗SSA抗體陰性患者相比,前者中總OAS1基因表達(dá)顯著增強(qiáng)。鑒于OAS1是干擾素調(diào)控的下游基因,我們還檢測(cè)了rs10774671與干燥綜合征患者的OAS1基因在受到干擾素刺激后表達(dá)變化之間的關(guān)系,結(jié)果證明二者無(wú)相關(guān)性。同時(shí),我們通過(guò)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)分析,發(fā)現(xiàn)與rs10774671表現(xiàn)連鎖不平衡關(guān)系(r20.95)的SNP位點(diǎn),部分分布在OAS3基因啟動(dòng)子區(qū)域,為探究OAS3在干燥綜合征發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮的作用,我們同樣檢測(cè)了rs10774671位點(diǎn)與對(duì)照組、疾病組和干擾素刺激的疾病樣本中總OAS3基因表達(dá)的關(guān)系,結(jié)果顯示該位點(diǎn)與OAS3基因表達(dá)沒(méi)有關(guān)聯(lián)。根據(jù)上述結(jié)論,rs10774671與疾病的發(fā)生具有顯著遺傳關(guān)聯(lián),然而基因表達(dá)數(shù)據(jù)表明該位點(diǎn)與總OAS1 m RNA表達(dá)無(wú)關(guān),為進(jìn)一步闡述rs10774671位點(diǎn)基因型突變后的致病機(jī)制,我們檢測(cè)了四種OAS1蛋白亞型(Transcript variant,TV)在疾病樣本中的基因表達(dá)與基因型的關(guān)系。已知rs10774671位點(diǎn)上發(fā)生“G”到“A”突變后,m RNA剪切前體無(wú)法識(shí)別原有序列引起錯(cuò)誤切割,因而形成三種新蛋白亞型(OAS1 TV2、TV3、TV4,對(duì)應(yīng)野生型OAS1 TV1、)。我們根據(jù)各亞型序列特點(diǎn),分別設(shè)計(jì)了特異性O(shè)AS1蛋白亞型引物序列,在三種基因型的疾病樣本中鑒定了各亞型的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明在野生純合子樣本中,OAS1 TV1亞型基因表達(dá)增強(qiáng),而在突變基因型樣本中,OAS1 TV2、TV3、TV4亞型表達(dá)增強(qiáng)。這一數(shù)據(jù)揭示了當(dāng)SNP位點(diǎn)的等位基因發(fā)生變化時(shí),機(jī)體表達(dá)出不同的OAS1蛋白亞型,結(jié)合新亞型應(yīng)答免疫能力降低的現(xiàn)象,我們從分子生物學(xué)水平闡明rs10774671基因突變的人群更易罹患干燥綜合征。已知OAS1蛋白可以通過(guò)Jak-STAT信號(hào)通路抵抗HBV病毒的感染與復(fù)制活性,為深入探究本研究中rs10774671位點(diǎn)與HBV感染關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制,我們分別構(gòu)建了四種OAS1亞型的表達(dá)載體,與HBV病毒表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染到肝細(xì)胞中,通過(guò)Western Blot、ELISA和熒光定量PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和上清中的HBc抗原的表達(dá),發(fā)現(xiàn)OAS1 TV1亞型的抗病毒能力明顯強(qiáng)于其他三種亞型。因此,當(dāng)rs10774671位點(diǎn)發(fā)生突變后,OAS1 TV1亞型蛋白表達(dá)降低,OAS1 TV2、TV3、TV4亞型表達(dá)增強(qiáng),但是新亞型的抗病毒能力下降,這一結(jié)論揭示了攜帶突變基因“A”的人群更易感染HBV病毒。本研究首次鑒定了OSA1基因上功能性SNP位點(diǎn)rs10774671與中國(guó)漢族干燥綜合征并發(fā)HBV感染的遺傳關(guān)聯(lián),并驗(yàn)證了rs10774671調(diào)控干燥綜合征發(fā)病和HBV感染的分子機(jī)制,有助于研究者們加強(qiáng)對(duì)于干燥綜合征易感基因和發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí),為推進(jìn)疾病的治療奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

致機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)攻擊自體的健康組織和細(xì)胞，因而產(chǎn)生病變 1933 年首次被描述，目前在我國(guó)的發(fā)病率可達(dá) 0.77%，女性患病比例九倍[3, 4]，通常在女性中年時(shí)期發(fā)病。根據(jù)發(fā)病方式的不同，該病可分干燥綜合征（primary Sj gren’s syndrome，pSS）和繼發(fā)性干燥綜condarySj gren’ssyndrome，sSS），本文以原發(fā)性干燥綜合征為主展開(kāi)討干燥綜合征的主要臨床癥狀為淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)淚腺、唾液腺等外分泌進(jìn)而液的產(chǎn)生，臨床常見(jiàn)表現(xiàn)包括眼睛干燥（干眼癥或干燥性角膜結(jié)膜炎）燥癥（圖 1.1）[5]。干燥性角膜結(jié)膜炎通常在患者體內(nèi)潛伏數(shù)年；干眼癥發(fā)角膜潰瘍和眼瞼感染[6]。干燥綜合征導(dǎo)致的口腔干燥可能會(huì)影響患者，并且在夜間也需要頻繁的飲水，，同時(shí)唾液的保護(hù)和抗菌特性的喪失可齲齒產(chǎn)生進(jìn)而促進(jìn)患者罹患口腔念珠菌病、腮腺腫脹和其他干燥癥，如、皮膚和陰道的干燥。干燥綜合征患者臨床表現(xiàn)多樣化，輕重程度不一展嚴(yán)重時(shí)還會(huì)累積腎臟、肺和肝臟等器官，甚至威脅生命[7, 8]。

自身抗原蛋白（白色）結(jié)合雙鏈 Y RNA（紅色）和色）的末端。e Ro autoantigen protein (white) binds the end of a doubRNA (red) and a single stranded RNA (blue). PDB: 1YV缺陷分子的降解。SSA/Ro60還可以與細(xì)胞中的RNApstein-Barr 病毒（EBV）的早期 RNA1（EBER1），S出以抗核糖體和抗染色質(zhì)抗體以及腎小球腎炎為特 SSA/Ro60 可能在預(yù)防系統(tǒng)性自身免疫疾病中具有重Ro60 作為可提取核抗原家族的重要成員之一，具有在lupuserythematosus，SLE）或原發(fā)性干燥綜合征的患能力[15]，同時(shí)抗 SSA 自身抗體與這些疾病中的炎癥上述結(jié)果為基礎(chǔ)，研究者提出 SSA/Ro60 識(shí)別宿主內(nèi)[18
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R593.2;R512.62

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2 李海珍;;以高球蛋白血癥性紫癜為主要表現(xiàn)的干燥綜合征1例[J];臨床皮膚科雜志;2018年03期

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本文編號(hào)：2689291