【摘要】：背景水痘一帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)具有嗜皮膚、神經(jīng)、淋巴細(xì)胞的特性,感染人體可引起水痘及帶狀皰疹,目前關(guān)于VZV感染機(jī)制的闡釋尚不明確。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解途徑,研究表明細(xì)胞自噬可防御病原體感染,而許多病原體,包括多種人類皰疹病毒進(jìn)化出多種機(jī)制來逃避、抑制甚至利用自噬。信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)在調(diào)節(jié)自噬過程中發(fā)揮重要作用,并且作為轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控多種病毒的復(fù)制和擴(kuò)散。目的明確VZV感染與自噬的相互關(guān)系,并探討STAT3信號通路在VZV感染中對自噬和病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)作用。方法1.流式細(xì)胞術(shù)檢測35例帶狀皰疹患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中自噬蛋白LC3B,Beclin-1、p62的表達(dá)情況,30例健康成人作為對照組;獲取12例帶狀皰疹患者皮損區(qū)標(biāo)本,免疫組化法檢測皮膚組織中相關(guān)自噬蛋白的表達(dá),透射電鏡觀察皮膚細(xì)胞內(nèi)自噬體的生成。2.VZV感染的SHSY5Y細(xì)胞中,MDC熒光染色觀察自噬體,western-blot檢測自噬蛋白LC3B-Ⅱ,Beclin-1、p62的表達(dá)。經(jīng)自噬誘導(dǎo)劑海藻糖和自噬抑制劑3-MA處理感染細(xì)胞后,檢測VZV滴度,q-PCR檢測VZV DNA拷貝值,western-blot 檢測 VZV 糖蛋白 E(glycoprotein E,gE)表達(dá)的變化。3.VZV感染的SHSY5Y細(xì)胞中,western-blot檢測STAT3、及其下游因子BNIP3的表達(dá)及磷酸化情況;經(jīng)S3I-201阻斷STAT3通路后,檢測自噬蛋白及VZV復(fù)制的變化;經(jīng)S3I-201阻斷STAT3通路后,應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑海藻糖,檢測自噬蛋白及VZV復(fù)制的變化。結(jié)果1.帶狀皰疹患者外周血CD4+T細(xì)胞中、皮損區(qū)皮膚組織中自噬蛋白LC3B,Beclin-1的表達(dá)明顯增高(P均0.05),p62的表達(dá)明顯降低(P0.05),皮損區(qū)皮膚細(xì)胞中自噬體數(shù)量明顯增高(P0.05)。2.VZV感染的SHSY5Y細(xì)胞中,自噬蛋白LC3B-Ⅱ,Beclin-1的表達(dá)明顯增高(P均0.05),p62的表達(dá)明顯降低(P0.05),對自噬進(jìn)行誘導(dǎo)/抑制后,病毒滴度明顯升高/降低,VZV DNA拷貝值明顯升高/降低,VZV gE的表達(dá)明顯升高/降低(P均0.05)。3.VZV感染的SHSY5Y細(xì)胞中,STAT3的表達(dá)及磷酸化、其下游因子BNIP3的表達(dá)明顯升高(P均0.05),抑制STAT3后,自噬水平明顯下降,VZV復(fù)制減弱,而自噬誘導(dǎo)劑海藻糖可逆轉(zhuǎn)這種減弱(P均0.05)。結(jié)論VZV感染后,T淋巴細(xì)胞、皮膚組織、神經(jīng)細(xì)胞中自噬水平升高,自噬的發(fā)生對病毒復(fù)制產(chǎn)生正性影響,此外,在VZV感染中,STAT3-BNIP3通路的活化可通過正性調(diào)控自噬的表達(dá)而調(diào)控VZV復(fù)制。探討病毒感染性疾病中自噬及其調(diào)節(jié)通路的作用,將為研究病毒復(fù)制機(jī)制及病原體-宿主相互作用機(jī)制提供見解。
【圖文】：

圖１－１外周血單個核細(xì)胞分離逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ邋ｂｌｏｏｄ邋ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ邋ｃｅｌｌｓ邋（ＰＢＭＣ）邋ｗｅｒｅ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ逡逑（５）向外周血單個核細(xì)胞沉淀中滴加適量的１０％ＮＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０細(xì)胞培養(yǎng)逡逑液，小心吹打混勻，用巴氏吸管吸取少量懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞活力檢測：逡逑①細(xì)胞計(jì)數(shù)：滴１滴細(xì)胞懸液于血球計(jì)數(shù)板上，蓋蓋玻片后靜置片刻，移至顯微鏡下，觀察并統(tǒng)計(jì)４角四個大方格中的細(xì)胞數(shù)，算出細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算、逡逑調(diào)整細(xì)胞濃度為１邋Ｘ邋１0６／１00邋ｕ邋Ｌ。逡逑②臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活力：用ＰＢＳ液將４％臺盼藍(lán)母液稀釋為０．４％的濃逡逑度。隨后，將細(xì)胞懸液與０．４％臺盼藍(lán)工作液９：１混合，滴加到載玻片上，并覆蓋玻片，轉(zhuǎn)移至顯微鏡下，，觀察統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞（未染色細(xì)胞）與死細(xì)胞（染為色的細(xì)胞）的數(shù)量，計(jì)算出活細(xì)胞的比例。細(xì)胞存活率應(yīng)大于９０％。逡逑（６）將新鮮外周血所分離出的單個核細(xì)胞，保存在４°Ｃ冰箱內(nèi)。２４小時(shí)內(nèi)逡逑進(jìn)行抗體標(biāo)記，上機(jī)流式檢測自噬蛋白ＬＣ－３Ｂ，Ｂｅｃｌｉｎ－］，ｐ６２在ＣＤ４＋Ｔ淋巴細(xì)胞逡逑

（５．７５±０．６７）邋％，而健康成人對照組外周血中ＣＤ４＋Ｔ淋巴細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白逡逑ＬＣ３Ｂ、Ｂｅｃｌｉｎ－１、ｐ６２邋的表達(dá)陽性率分別為（３６．５６±４．２７）邋％、（１５．３４±１．８９）邋％、逡逑（１０．０３±１．１５）邋％邋（圖１－２）。與健康成人對照組相比，帶狀皰疹患者ＣＤ４＋Ｔ淋逡逑巴細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白ＬＣ３Ｂ，Ｂｅｃｌｉｎ－１的表達(dá)明顯增高（ＰＣ０．０１）邋，邋ｐ６２的表逡逑達(dá)明顯降低（Ｐ＜０．０１）。這表明ＶＺＶ感染后ＣＤ４＋Ｔ淋巴細(xì)胞中自噬水平增高，逡逑并且自噬流是通暢的。逡逑１７逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R511.5;R752.12

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本文編號：2683367