發(fā)布時間：2020-05-26 23:15

【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性消耗性人畜共患病。我國屬于全球結(jié)核病疫情高發(fā)區(qū)。隨著環(huán)境污染,多耐藥菌株的出現(xiàn)和艾滋病傳播的不斷加劇,結(jié)核病的發(fā)病率也越來越高,嚴(yán)重威脅著人類健康。結(jié)核病防治面臨的瓶頸問題是缺乏特異性的早期診斷標(biāo)識,因此迫切需要尋找靈敏度高、特異性好的分子靶標(biāo)以及發(fā)展低成本,無創(chuàng)取樣的檢測程序。目前蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)已廣泛應(yīng)用于血液、尿液等各種體液研究中,成為各種疾病研究的組學(xué)工具。本研究以肺結(jié)核病人的尿液及血液診斷標(biāo)志物為出發(fā)點(diǎn),從尿液中篩選到能作為肺結(jié)核病診斷的生物標(biāo)志物甘露糖結(jié)合凝集素2(MBL2),35 k Da間α胰蛋白酶抑制劑H4(ITIH4-35k),視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)和miR-625-3p,并建立了尿液蛋白質(zhì)-micro RNA聯(lián)合診斷模型;從血液中篩選到具有潛在診斷意義的分子標(biāo)志物miRNA-362-5p,并對其調(diào)控結(jié)核分枝桿菌介導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制進(jìn)行了深入研究;同時對結(jié)核分枝桿菌RD區(qū)炎性蛋白YrbE3A(Rv1964)進(jìn)行了深入研究,從體內(nèi)和體外水平證實了YrbE3A激活機(jī)體固有免疫的致病機(jī)制,為揭示結(jié)核分枝桿菌持續(xù)致病及RD區(qū)蛋白作為結(jié)核病特異性診斷抗原提供理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下:(1)肺結(jié)核病新型診斷標(biāo)志物的篩選及鑒定應(yīng)用雙向電泳和基質(zhì)輔助激光解吸/電離時間的飛行質(zhì)譜對45例初治肺結(jié)核患者和45例卡介苗免疫健康對照者尿液樣本進(jìn)行了檢測,初步篩選出19個差異表達(dá)尿蛋白。隨后基于Western Blotting和SYBR green q RT-PCR方法對122例初治肺結(jié)核患者和73例卡介苗免疫健康對照者尿液樣本進(jìn)行了翻譯和轉(zhuǎn)錄水平的驗證。最終結(jié)果顯示:MBL2,ITIH4-35k,RBP4具有較高的靈敏度和特異性。進(jìn)一步對其進(jìn)行尿蛋白-靶標(biāo)micro RNA互作網(wǎng)絡(luò)分析,篩選出11個靶標(biāo)mcroi RNAs,并利用SYBR green q RT-PCR在痰涂片52例陰性結(jié)核患者,46例陽性結(jié)核患者和48例健康對照組尿液中進(jìn)行了驗證,確定RBP4和ITIH4-35k的共同靶micro RNA:miR-625-3p具有肺結(jié)核病診斷的潛在價值。因此,MBL2,ITIH4-35k,RBP4和miR-625-3p均可作為肺結(jié)核病診斷標(biāo)識獨(dú)立檢測。進(jìn)一步基于多元邏輯回歸構(gòu)建肺結(jié)核尿液臨床診斷蛋白和micro RNA聯(lián)合診斷模型:Y=0.329miR625-3p+0.639MBL2+0.746ITIH4-4.502。聯(lián)合檢測診斷肺結(jié)核的診斷效能優(yōu)于各指標(biāo)單項檢測,敏感性達(dá)到85.87%(95%CI 77.05% 92.26%),特異性為87.50%(95%CI 74.75% 95.27%)。新型尿液蛋白和micro RNA診斷標(biāo)識為結(jié)核病的診斷提供新的思路與進(jìn)步。(2)miR-362-5p對結(jié)核分枝桿菌逃避宿主免疫反應(yīng)調(diào)控作用的研究篩選到具有診斷意義的血液學(xué)分子標(biāo)識miRNA-362-5p。在結(jié)核分枝桿菌感染的人巨噬細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)和小鼠巨噬細(xì)胞(RAW246.7細(xì)胞)中miRNA-362-5p的表達(dá)顯著下調(diào),并具有時間依賴性。對75例臨床肺結(jié)核病患者,39例鑒別診斷組(肺部疾病病人)和40例健康對照組的外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)樣品中的miR-362-5p的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)miR-362-5p在肺結(jié)核組中的表達(dá)水平低于肺部疾病組和健康對照組(p0.001)。表明結(jié)核分枝桿菌侵染機(jī)體,miRNA-362-5p的表達(dá)水平在體內(nèi)和體外均特異性下調(diào)。進(jìn)一步確定了miRNA-362-5p能夠通過激活p38 MAPK和NF-κB信號通路正向調(diào)控結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá),從而使結(jié)核分枝桿菌逃避宿主免疫,增加胞內(nèi)存活量。同時巨噬細(xì)胞通過抑制其吞噬結(jié)核分枝桿菌的能力保護(hù)自身。(3)結(jié)核分枝桿菌蛋白YrbE3A正向調(diào)控宿主固有免疫的機(jī)制研究為了進(jìn)一步闡明結(jié)核分枝桿菌蛋白YrbE3A與巨噬細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制,構(gòu)建表達(dá)YrbE3A的恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis,MS)MS_YrbE3A和卡介苗巴斯德株BCG_YrbE3A,并感染小鼠巨噬細(xì)胞(RAW246.7細(xì)胞),發(fā)現(xiàn)YrbE3A蛋白通過NF-κB和Jnk MAPK信號通路正向調(diào)控炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá),激活機(jī)體固有免疫殺傷和清除病原菌。隨后利用MS_YrbE3A感染C57BL/6小鼠,通過肺組織CFU計數(shù)、病理學(xué)切片、免疫組化和多因子免疫檢測等方法,同樣證實了YrbE3A蛋白能夠引發(fā)高水平炎性細(xì)胞因子激活免疫反應(yīng)從而促進(jìn)宿主清除恥垢分枝桿菌。綜上,本研究篩選到具有潛在診斷意義的分子標(biāo)識MBL2,ITIH4-35k,RBP4和miR-625-3p,并建立了尿液蛋白質(zhì)-micro RNA聯(lián)合診斷模型;確定了肺結(jié)核血液診斷標(biāo)識分子miRNA-362-5p正向調(diào)控結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及YrbE3A通過NF-κB/JNK信號通路激活宿主固有免疫,對肺結(jié)核的診斷和治療提供理論依據(jù)。
【圖文】：

2000 年下降 170 萬人）（WHO 2017）（圖 1-1）。2015 年提出 終止結(jié)核病戰(zhàn)略（2016-2035），到 2020 年結(jié)核病死亡病例和新發(fā)病例人數(shù)應(yīng)在 2015 年的基礎(chǔ)上別下降 35%和 20%，，到 2030 年這兩個指標(biāo)要比 2015 年分別下降 90%和 80%（WH2015）。同時，由于 HIV 合并結(jié)核感染（40%的 HIV 死亡病例是感染結(jié)核造成的和耐多藥及多耐藥結(jié)核菌株，大規(guī)模人口流動等問題的出現(xiàn)，增大了結(jié)核病疫情控制難度。因此為了控制結(jié)核病，減少疾病的流行和提高治療效果，發(fā)展準(zhǔn)確、速和簡單的診斷方法顯得十分迫切。

結(jié)核分枝桿菌通常在只存在于器官組織中，血液中一般不含菌，但是血清和 PBMC 可以隨全身循環(huán)流經(jīng)致病組織，接受免疫細(xì)胞或結(jié)核抗原傳遞的信號。圖 1-3 以一個肺結(jié)核肺肉芽腫模型演示循環(huán) microRNA 如何應(yīng)答 MTB 刺激并從感染部位進(jìn)入血液循環(huán)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的。肉芽腫內(nèi)的巨噬細(xì)胞和 T 細(xì)胞感受 MTB刺激后調(diào)控成熟 microRNA 的種類和表達(dá)量，不同的 microRNAs 能夠調(diào)節(jié)不同的信號通路和免疫組分，例如參與肉芽腫形成和維持的 T 淋巴細(xì)胞通過上調(diào)特異性的microRNA-T 細(xì)胞激活獲得性免疫。巨噬細(xì)胞和 T 細(xì)胞中產(chǎn)生的成熟 microRNAs 能夠隨著外泌體或與高密度脂蛋白或其他蛋白質(zhì)復(fù)合物一起被釋放出來，隨后通過血管上皮細(xì)胞進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)。由此，血清和外周血淋巴細(xì)胞中的 microRNAs 能夠代表這些信號，作為一種新型標(biāo)志物在結(jié)核病的診斷和治療中( Miotto et al 2013,Zhang et al 2013, Xu et al 2015,Wagh et al 2017)，再加上 microRNAs 具有高度的特異性和敏感性，在結(jié)核診斷和治療中可以發(fā)揮巨大的生物學(xué)價值。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S855.2;R521

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本文編號：2682550