【摘要】：目的:探討結核分枝桿菌pks12(Rv2048c)基因?qū)Y核分枝桿菌在巨噬細胞內(nèi)存活的影響及其機制。方法:利用噬菌體介導的結核分枝桿菌基因敲除技術敲除實驗室標準菌株H37Rv pks12基因。通過抗酸染色及固體培養(yǎng)觀察敲除菌株的形態(tài)變化以及通過測定生長曲線觀察敲除株的生長情況,比較敲除株H37RvΔRv2048c及H37Rv-WT株(野生型)感染巨噬細胞后結核分枝桿菌的存活能力,通過Real-time PCR及Elisa技術從m RNA及蛋白質(zhì)水平了解pks12對受感染的巨噬細胞炎癥細胞因子表達水平的影響,通過Western blot進一步了解調(diào)節(jié)炎癥細胞因子表達的相關炎癥信號通路,進一步探討結核病的發(fā)病機制。結果:成功敲除H37Rv基因組中pks12基因;pks12基因敲除使結核分枝桿菌生長速率減慢,菌落由R型轉變?yōu)镾型;H37RvΔRv2048c菌株在巨噬細胞內(nèi)的存活能力明顯低于H37Rv-WT;m RNA水平及蛋白質(zhì)水平檢測結果顯示,H37RvΔRv2048c促進結核分枝桿菌感染巨噬細胞TNF-α和IL-6表達量顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義,且促進NF-κB信號通路中p65蛋白及IκBα的磷酸化水平顯著上調(diào)。結論:pks12缺失可促進細胞因子TNF-α與IL-6的分泌,有利于宿主細胞清除結核分枝桿菌,不利于結核分枝桿菌逃逸宿主細胞的免疫攻擊,抑制結核分枝桿菌在感染巨噬細胞中的存活,其可能機制是pks12通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)巨噬細胞炎癥細胞因子的表達。本研究進一步了解了結核病的發(fā)病機制并為藥物的研究提供了新靶點。
【圖文】：

NAMini 柱裝入 2 mL 收集管中。將步驟 8 中移到色譜柱中。10000 rpm 離心 1 min 后丟第二個 2mL 收集管中，加入 500μLBuffer，將吸附柱再次放入收集管中。入 700μL 用乙醇稀釋的 DNA 洗滌緩沖液洗。心 2 min 以干燥吸附柱。 1.5 mLEP 管（去酶）中，，向吸附膜中央懸沖液，室溫下孵育 3~5 min，12000 rpm 離心脫液被再次滴入吸附柱中，室溫靜置 2 min基因組 DNA。構建（如圖 1 所示）

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【學位授予單位】：遵義醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R52

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1 王鴻;pks12敲除對結核分枝桿菌存活影響及機制研究[D];遵義醫(yī)科大學;2019年

本文編號：2680924