【摘要】：目的:構(gòu)建新型雙分子表達(dá)靶向DC慢病毒載體LVDC-UbHBcAg-LIGHT;明確該重組慢病毒在BALB/c小鼠體外和體內(nèi)是否能靶向轉(zhuǎn)染DC;探討LIGHT是否能協(xié)同誘導(dǎo)HBV特異性CTL免疫反應(yīng);比較LVDC-UbHBcAg-LIGHT和LV-UbHBcAg-LIGHT誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)的能力,并進(jìn)一步驗(yàn)證LVDC-UbHBcAg-LIGHT在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的抗病毒作用;探討細(xì)胞自噬、凋亡和周期及以上通路相關(guān)蛋白在T細(xì)胞激活中蛋白水平的變化及相互作用,闡明LVDC-UbHBcAg-LIGHT介導(dǎo)的CTLs活化機(jī)制。方法:1.在本實(shí)驗(yàn)室之前合成并保存質(zhì)粒pLOV-UBC-Ub-HBcAg-EGFP-3FLAG的基礎(chǔ)上進(jìn)行雙酶切,插入新合成的EGFP-P2A-Tnfsf14-3FLAG基因,得到雙分子表達(dá)質(zhì)粒pLOV-UBC-Ub-HBcAg-EGFP-P2A-LIGHT-3FLAG;封閉SVG基因的硫酸乙酰肝素受體結(jié)合位點(diǎn)而保留DC-SIGN結(jié)合位點(diǎn),得到能靶向DC的包膜質(zhì)粒SVGmu;進(jìn)而包裝成重組慢病毒載體LVDC-UbHBcAg-LIGHT。2.建立表達(dá)梯度DC-SIGN蛋白水平的293T細(xì)胞模型,分別用LVDC-UbHBcAg-LIGHT和LV-UbHBcAg-LIGHT轉(zhuǎn)染以上293T細(xì)胞株,比較二者在各293T細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染率與DC-SIGN水平的關(guān)系;分別用LVDC-UbHBcAg-LIGHT和LV-UbHBcAg-LIGHT轉(zhuǎn)染小鼠骨髓混合細(xì)胞,流式細(xì)胞儀比較兩者對(duì)骨髓細(xì)胞中DC轉(zhuǎn)染的特異性;檢測DC-SIGN單克隆抗體阻斷劑作用前后LVDC-UbHBcAg-LIGHT和LV-UbHBcAg-LIGHT對(duì)小鼠髓源性DC轉(zhuǎn)染率的變化;構(gòu)建含有熒光素酶報(bào)告基因的靶向慢病毒LVDC-luc和非靶向慢病毒LV-luc并于皮下免疫BALB/c小鼠,一個(gè)月后,活體成像檢測發(fā)光信號(hào)在小鼠注射部位和體內(nèi)臟器的分布情況。3.檢測各組慢病毒促進(jìn)DC成熟的能力;將負(fù)載不同慢病毒的DC分別與小鼠同源性T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),檢測各組HBV特異性的CD8+T細(xì)胞反應(yīng),流式檢測各組細(xì)胞凋亡和周期,并探討自噬通路相關(guān)蛋白、細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白在T細(xì)胞激活中表達(dá)的變化以及自噬阻斷對(duì)T細(xì)胞激活以及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響。4.將各組慢病毒分別免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,檢測各組小鼠體內(nèi)HBV特異性CTL反應(yīng)、血清HBsAg和HBV DNA水平、肝細(xì)胞中HBsAg和HBcAg的蛋白表達(dá);檢測自噬通路相關(guān)蛋白、凋亡和周期相關(guān)蛋白的表達(dá)及上述蛋白在CD8+T細(xì)胞內(nèi)共定位和相互作用的關(guān)系,以探討自噬促進(jìn)T細(xì)胞激活的機(jī)制。結(jié)果:1.基因測序和Western blot證實(shí)LVDC-UbHBcAg-LIGHT構(gòu)建成功。2.隨著293T細(xì)胞中DC-SIGN蛋白水平的增高,LVDC-UbHBcAg-LIGHT的轉(zhuǎn)染率也逐漸增高,而LV-UbHBcAg-LIGHT的轉(zhuǎn)染率與DC-SIGN的表達(dá)無關(guān);LV-UbHBcAg-LIGHT能高效轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細(xì)胞,但特異性轉(zhuǎn)染DC的能力較低,LVDC-UbHBcAg-LIGHT雖轉(zhuǎn)染骨髓細(xì)胞的能力較弱,但特異性轉(zhuǎn)染其中DC的能力較強(qiáng);單克隆抗體阻斷劑封閉DC-SIGN后,LVDC-UbHBcAg-LIGHT對(duì)BMDC的轉(zhuǎn)染率顯著減低,而阻斷劑對(duì)LV-UbHBcAg-LIGHT的轉(zhuǎn)染率無顯著影響;活體成像顯示LVDC-UbHBcAg-LIGHT組小鼠的注射部位及體內(nèi)任何臟器均檢測不到發(fā)光信號(hào),而LV-UbHBcAg-LIGHT組小鼠的上述部位可檢測到不同強(qiáng)度的發(fā)光信號(hào)。3.LVDC-UbHBcAg-LIGHT轉(zhuǎn)染DC后,DC表面激活標(biāo)記物的表達(dá)以及IL-12p的分泌均明顯高于LVDC-UbHBcAg轉(zhuǎn)染組,而LVDC-UbHBcAg-LIGHT組和LV-UbHBcAg-LIGHT組之間無顯著差異;不同慢病毒負(fù)載DC均可不同程度地刺激T細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,增強(qiáng)CTL的殺傷活性;其中LVDC-UbHBcAg-LIGHT負(fù)載DC組對(duì)T細(xì)胞的以上激活作用均顯著高于LVDC-UbHBcAg組,而LVDC-UbHBcAg-LIGHT負(fù)載DC組和LV-UbHBcAg-LIGHT負(fù)載DC組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;此外,自噬在激活的CD8+T細(xì)胞中被明顯誘導(dǎo),與此同時(shí)細(xì)胞凋亡顯著減少,細(xì)胞大量進(jìn)入S-期并進(jìn)行大量增殖,HBV特異性T細(xì)胞反應(yīng)均明顯增強(qiáng);自噬途徑阻斷后,凋亡和周期相關(guān)蛋白的表達(dá)迅速增高,細(xì)胞凋亡顯著增多,細(xì)胞進(jìn)入S-期受到阻滯,增殖能力減弱,HBV特異性T細(xì)胞反應(yīng)均明顯降低。4.不同慢病毒直接免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠后均能不同程度地誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,增強(qiáng)特異性CTL殺傷活性,其中LVDC-UbHBcAg-LIGHT對(duì)以上T細(xì)胞的激活作用均明顯高于其它組;LVDC-UbHBcAg-LIGHT能顯著降低轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織HBsAg、HBcAg的表達(dá)以及血清HBsAg、HBV DNA水平;LVDC-UbHBcAg-LIGHT免疫小鼠的CD8+T細(xì)胞中凋亡和周期相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著降低,細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng),而凋亡細(xì)胞的百分比則明顯降低,對(duì)應(yīng)T細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng);激光共聚焦和免疫沉淀結(jié)果證實(shí)激活的CD8+T細(xì)胞中泛素、自噬受體p62與凋亡或周期蛋白以聚合物的形式存在。結(jié)論:重組慢病毒LVDC-UbHBcAg-LIGHT在體內(nèi)和體外均能靶向轉(zhuǎn)染小鼠DC,具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)的能力,并可在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的抗病毒效應(yīng);LVDC-UbHBcAg-LIGHT介導(dǎo)激活的CD8+T細(xì)胞中廣泛誘導(dǎo)的自噬通過選擇性降解周期和凋亡相關(guān)蛋白,從而抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞大量增殖活化為具有殺傷效應(yīng)的CTLs。
【圖文】：

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文圖 1-1 pLOV-UBC-Ub-HBcAg-EGFP-P2A-LIGHT-3FLAG 表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖Fig1-1 The schematic diagram of pLOV-UBC-Ub-HBcAg-EGFP-P2A-LIGHT-3FLAG expressionvector3.2. 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒 pLOV-UBC-DC-SIGN-3FLAG 的結(jié)構(gòu)示意圖用 EcoRI 和 NheI 對(duì)質(zhì)粒 H134 pLenti-Ubc-EGFP-3FLAG 進(jìn)行雙酶切，切掉其中的 EGFP 片段，以避免表達(dá)的綠色熒光蛋白對(duì)后續(xù)的病毒靶向性鑒定實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響；然后將剩下的載體與經(jīng)擴(kuò)增、純化的 Cd209a（即 DC-SIGN）基因片段進(jìn)行連接，得到表達(dá)質(zhì)粒 H4723 pLenti-Ubc-Cd209a-3FLAG（見圖 1-2）。

圖 1-3 H4738 pHCMV-SVG 包膜質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖Fig1-3 The schematic diagram of pHCMV-SVG envelope vector3.4. 重組克隆菌落中陽性克隆的測序結(jié)果將 菌 落 PCR 陽 性 克 隆 送 測 序 ， 經(jīng) 序 列 比 對(duì) ， 插 入 目 的 基 因EGFP-P2A-Tnfsf14-3FLAG 及 DC-SIGN 的 序 列 正 確 ， H4725（ pLOV-UBC-Ub-HBcAg-EGFP-P2A-LIGHT-3FLAG ） 及 H4723（pLOV-UBC-DC-SIGN-3FLAG）構(gòu)建成功，測序圖分別見圖 1-4 及圖 1-5。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：2669008