【摘要】：[目的]本研究通過上調(diào)體內(nèi)外MicroRNA 133b(miR-133b)的表達,探索miR-133b在日本血吸蟲肝纖維化中的作用及機制。[方法]培養(yǎng)肝星狀細胞(LX-2),使用不同濃度的TGF-β1,在不同時間點刺激LX-2細胞,采用TGF-β1最佳濃度和時間處理LX-2細胞,利用瞬時轉染技術,分別將miR-133b mimics、miR-133b mimics NC、miR-133b inhibitor mimics及miR-133b inhibitor NC質粒轉染至LX-2細胞中。qRT-PCR分別檢測LX-2細胞中miR-133b、TGF-β1、Smad3、CTGF、Colla I和α-SMA等分子mRNA的轉錄水平。構建以慢病毒為載體的miR-133b病毒質粒(Lenti-miR-133b)和陰性對照質粒(Lenti-NC)。將6~8周齡雌性KM小鼠隨機分成4組,采用尾蚴腹部敷貼法攻擊小鼠,未經(jīng)尾蚴攻擊的小鼠為未感染組,其余小鼠為感染組。尾蚴攻擊小鼠一周后,經(jīng)小鼠尾靜脈分別注射PBS以及Lenti-NC(1×10~9 TU/mL)和Lenti-miR-133b(1×10~9 TU/mL)的慢病毒質粒,分別在尾蚴攻擊后的第4w、6w和8w進行麻醉,摘取肝組織及經(jīng)眼球取血為后續(xù)實驗做準備。利用qRT-PCR檢測各組小鼠肝組織中miR-133b、纖維化相關分子CTGF、Colla I和α-SMA以及炎癥相關因子IL-4和IFN-γ的轉錄水平;ELISA法鑒定血清中IL-4和IFN-γ的水平;western-blot方法檢測CTGF在肝組織中的蛋白表達水平;HE染色和Masson三色染色評估小鼠肝組織肉芽腫及纖維化變化;試劑盒分析小鼠肝組織中羥脯氨酸含量及血清中ALT含量。[結果]細胞實驗結果顯示:經(jīng)TGF-β1處理的LX-2細胞中miR-133b的表達持續(xù)下調(diào),且具有時間濃度依賴性。LX-2細胞中轉染miR-133b mimics后,miR-133b的表達顯著上升。熒光定量PCR顯示:轉染miR-133b mimics可顯著抑制由TGF-β1誘導的CTGF、Colla I和α-SMA的表達(P0.05),但是對于TGF-β1和Smad3的表達沒有影響。動物實驗結果顯示:在血吸蟲尾蚴感染后4w、6w和8w的小鼠肝組織中miR-133b的表達持續(xù)減少,經(jīng)Lenti-miR-133b處理后,miR-133b的表達顯著上調(diào)(P0.05)。熒光定量PCR顯示:感染組小鼠肝組織中的纖維化相關因子CTGF、Colla I和α-SMA表達均顯著高于未感染組(P0.05);Lenti-miR-133b處理組小鼠肝組織中CTGF、Colla I和α-SMA表達水平明顯低于PBS組和慢病毒陰性對照組(P0.05)。HE染色和Masson三色染色結果表明:蟲卵肉芽腫和纖維化在小鼠感染6w后改變明顯,與PBS組和慢病毒陰性對照組比較,miR-133b處理組肝臟病變程度明顯減輕。肝組織羥脯氨酸含量分析顯示:與未感染組比較,感染組小鼠肝組織羥脯氨酸含量顯著升高(P0.01);小鼠在尾蚴攻擊后第6w和第8w,miR-133b處理組小鼠羥脯氨酸含量顯著低于PBS組和慢病毒陰性對照組(P0.05)。血清ALT表達水平分析顯示:小鼠感染后4w和第6w,感染組小鼠血清ALT水平顯著高于未感染組(P0.05);與PBS和慢病毒陰性對照組比較,miR-133b處理組小鼠血清中ALT水平降低(P0.05)。熒光定量PCR和ELISA分析表明:與未感染組比較,感染組小鼠肝組織和血清中IL-4分泌水平在尾蚴攻擊后逐漸升高(P0.05);IFN-γ在尾蚴攻擊后第4w顯著升高(P0.05),第6w和第8w下降;但是各感染組中IL-4和IFN-γ的表達沒有顯著差異。[結論]miR-133b可能通過靶向沉默CTGF的表達抑制HSC的活化以及膠原的沉積減輕小鼠血吸蟲病肝纖維化。
【圖文】：

研究表明活化的 HSC 對血吸蟲病肝纖維化至關重要，為了探究 miR-133b 在HSC 中的表達水平，我們選用人源肝星狀細胞 LX-2 細胞為研究對象。因為 TGF-β1 是激活 HSC 的重要細胞因子，所以我們使用 TGF-β1 刺激 LX-2 細胞，體外模擬活化的 HSC。實驗中使用 TGF-β1（15ng/mL）處理 LX-2 細胞 0h、12h、24h和 48h。如圖 4.1A 所示，隨著處理時間的延長 miR-133b 的表達逐漸下降，0h 與24h、48h 小時比較有顯著差異（P㩳0.05），24h 和 48h 之間沒有顯著性差異，以24h 做為后續(xù)實驗的最佳處理時間。使用濃度為 0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL 和15ng/mL 的 TGF-β1 處理 LX-2 細胞 24h。如圖 4.1 B 所示，miR-133b 的表達被TGF-β1 持續(xù)下調(diào)，0ng/mL 與 10ng/mL 和 15ng/mL 比較有顯著差異（P㩳0.05），10ng/mL 和 15ng/mL 之間沒有顯著性差異，以 10ng/mL 做為后續(xù)實驗的最佳刺激濃度。說明經(jīng)不同濃度不同時間的 TGF-β1 處理 LX-2 后 miR-133b 的表達顯著下調(diào)（圖 4.1）。

圖 4.2 qRT-PCR 檢測 LX-2 細胞中 miR-133b 的表達Fig.4.2 The expression of miR-133b in LX-2 cell was detected by qRT-PCR##: P<0.01 vs PBS group and TGF-β1group and TGF-β1+miR-133b mimics NC group4.2 上調(diào) miR-133b 對 TGF-β/SMAD 通路相關分子的影響因為 TGF-β/Smad 信號通路是激活 HSC，促進纖維化的重要信號途徑，，為了探究 miR-133b 是否涉及 TGF-β/Smad 信號通路，我們將細胞隨機分為六組：空白對照組(PBS 組)、TGF-β1 組、TGF-β1+ miR-133b inhibitor negative control 組TGF-β1+ miR-133b inhibitor 組、TGF-β1+ miR-133b negative control mimics 組和TGF-β1+miR-133bmimics 組，檢測 LX-2 細胞中 TGF-β1、Smad3、CTGFmRN的表達。結果顯示，與 PBS 組比較，TGF-β1 組、陰性對照組及抑制劑組均顯著上調(diào) TGF-β1、Smad3、CTGFmRNA 的表達水平（P㩳0.05）；與 TGF-β1 組、陰性對照組及抑制劑組比較，過表達miR-133b則顯著抑制CTGF的表達（P㩳0.05）而對 TGF-β1 及 Smad3 的表達無顯著影響（圖 4.3-圖 4.5）。
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R532.21;R575.2

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本文編號：2659066