【摘要】：[目的]本研究通過(guò)上調(diào)體內(nèi)外MicroRNA 133b(miR-133b)的表達(dá),探索miR-133b在日本血吸蟲肝纖維化中的作用及機(jī)制。[方法]培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞(LX-2),使用不同濃度的TGF-β1,在不同時(shí)間點(diǎn)刺激LX-2細(xì)胞,采用TGF-β1最佳濃度和時(shí)間處理LX-2細(xì)胞,利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù),分別將miR-133b mimics、miR-133b mimics NC、miR-133b inhibitor mimics及miR-133b inhibitor NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至LX-2細(xì)胞中。qRT-PCR分別檢測(cè)LX-2細(xì)胞中miR-133b、TGF-β1、Smad3、CTGF、Colla I和α-SMA等分子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。構(gòu)建以慢病毒為載體的miR-133b病毒質(zhì)粒(Lenti-miR-133b)和陰性對(duì)照質(zhì)粒(Lenti-NC)。將6~8周齡雌性KM小鼠隨機(jī)分成4組,采用尾蚴腹部敷貼法攻擊小鼠,未經(jīng)尾蚴攻擊的小鼠為未感染組,其余小鼠為感染組。尾蚴攻擊小鼠一周后,經(jīng)小鼠尾靜脈分別注射PBS以及Lenti-NC(1×10~9 TU/mL)和Lenti-miR-133b(1×10~9 TU/mL)的慢病毒質(zhì)粒,分別在尾蚴攻擊后的第4w、6w和8w進(jìn)行麻醉,摘取肝組織及經(jīng)眼球取血為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。利用qRT-PCR檢測(cè)各組小鼠肝組織中miR-133b、纖維化相關(guān)分子CTGF、Colla I和α-SMA以及炎癥相關(guān)因子IL-4和IFN-γ的轉(zhuǎn)錄水平;ELISA法鑒定血清中IL-4和IFN-γ的水平;western-blot方法檢測(cè)CTGF在肝組織中的蛋白表達(dá)水平;HE染色和Masson三色染色評(píng)估小鼠肝組織肉芽腫及纖維化變化;試劑盒分析小鼠肝組織中羥脯氨酸含量及血清中ALT含量。[結(jié)果]細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)TGF-β1處理的LX-2細(xì)胞中miR-133b的表達(dá)持續(xù)下調(diào),且具有時(shí)間濃度依賴性。LX-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-133b mimics后,miR-133b的表達(dá)顯著上升。熒光定量PCR顯示:轉(zhuǎn)染miR-133b mimics可顯著抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF、Colla I和α-SMA的表達(dá)(P0.05),但是對(duì)于TGF-β1和Smad3的表達(dá)沒有影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在血吸蟲尾蚴感染后4w、6w和8w的小鼠肝組織中miR-133b的表達(dá)持續(xù)減少,經(jīng)Lenti-miR-133b處理后,miR-133b的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05)。熒光定量PCR顯示:感染組小鼠肝組織中的纖維化相關(guān)因子CTGF、Colla I和α-SMA表達(dá)均顯著高于未感染組(P0.05);Lenti-miR-133b處理組小鼠肝組織中CTGF、Colla I和α-SMA表達(dá)水平明顯低于PBS組和慢病毒陰性對(duì)照組(P0.05)。HE染色和Masson三色染色結(jié)果表明:蟲卵肉芽腫和纖維化在小鼠感染6w后改變明顯,與PBS組和慢病毒陰性對(duì)照組比較,miR-133b處理組肝臟病變程度明顯減輕。肝組織羥脯氨酸含量分析顯示:與未感染組比較,感染組小鼠肝組織羥脯氨酸含量顯著升高(P0.01);小鼠在尾蚴攻擊后第6w和第8w,miR-133b處理組小鼠羥脯氨酸含量顯著低于PBS組和慢病毒陰性對(duì)照組(P0.05)。血清ALT表達(dá)水平分析顯示:小鼠感染后4w和第6w,感染組小鼠血清ALT水平顯著高于未感染組(P0.05);與PBS和慢病毒陰性對(duì)照組比較,miR-133b處理組小鼠血清中ALT水平降低(P0.05)。熒光定量PCR和ELISA分析表明:與未感染組比較,感染組小鼠肝組織和血清中IL-4分泌水平在尾蚴攻擊后逐漸升高(P0.05);IFN-γ在尾蚴攻擊后第4w顯著升高(P0.05),第6w和第8w下降;但是各感染組中IL-4和IFN-γ的表達(dá)沒有顯著差異。[結(jié)論]miR-133b可能通過(guò)靶向沉默CTGF的表達(dá)抑制HSC的活化以及膠原的沉積減輕小鼠血吸蟲病肝纖維化。
【圖文】：

研究表明活化的 HSC 對(duì)血吸蟲病肝纖維化至關(guān)重要，為了探究 miR-133b 在HSC 中的表達(dá)水平，我們選用人源肝星狀細(xì)胞 LX-2 細(xì)胞為研究對(duì)象。因?yàn)?TGF-β1 是激活 HSC 的重要細(xì)胞因子，所以我們使用 TGF-β1 刺激 LX-2 細(xì)胞，體外模擬活化的 HSC。實(shí)驗(yàn)中使用 TGF-β1（15ng/mL）處理 LX-2 細(xì)胞 0h、12h、24h和 48h。如圖 4.1A 所示，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng) miR-133b 的表達(dá)逐漸下降，0h 與24h、48h 小時(shí)比較有顯著差異（P㩳0.05），24h 和 48h 之間沒有顯著性差異，以24h 做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳處理時(shí)間。使用濃度為 0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL 和15ng/mL 的 TGF-β1 處理 LX-2 細(xì)胞 24h。如圖 4.1 B 所示，miR-133b 的表達(dá)被TGF-β1 持續(xù)下調(diào)，0ng/mL 與 10ng/mL 和 15ng/mL 比較有顯著差異（P㩳0.05），10ng/mL 和 15ng/mL 之間沒有顯著性差異，以 10ng/mL 做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳刺激濃度。說(shuō)明經(jīng)不同濃度不同時(shí)間的 TGF-β1 處理 LX-2 后 miR-133b 的表達(dá)顯著下調(diào)（圖 4.1）。

圖 4.2 qRT-PCR 檢測(cè) LX-2 細(xì)胞中 miR-133b 的表達(dá)Fig.4.2 The expression of miR-133b in LX-2 cell was detected by qRT-PCR##: P<0.01 vs PBS group and TGF-β1group and TGF-β1+miR-133b mimics NC group4.2 上調(diào) miR-133b 對(duì) TGF-β/SMAD 通路相關(guān)分子的影響因?yàn)?TGF-β/Smad 信號(hào)通路是激活 HSC，促進(jìn)纖維化的重要信號(hào)途徑，，為了探究 miR-133b 是否涉及 TGF-β/Smad 信號(hào)通路，我們將細(xì)胞隨機(jī)分為六組：空白對(duì)照組(PBS 組)、TGF-β1 組、TGF-β1+ miR-133b inhibitor negative control 組TGF-β1+ miR-133b inhibitor 組、TGF-β1+ miR-133b negative control mimics 組和TGF-β1+miR-133bmimics 組，檢測(cè) LX-2 細(xì)胞中 TGF-β1、Smad3、CTGFmRN的表達(dá)。結(jié)果顯示，與 PBS 組比較，TGF-β1 組、陰性對(duì)照組及抑制劑組均顯著上調(diào) TGF-β1、Smad3、CTGFmRNA 的表達(dá)水平（P㩳0.05）；與 TGF-β1 組、陰性對(duì)照組及抑制劑組比較，過(guò)表達(dá)miR-133b則顯著抑制CTGF的表達(dá)（P㩳0.05）而對(duì) TGF-β1 及 Smad3 的表達(dá)無(wú)顯著影響（圖 4.3-圖 4.5）。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R532.21;R575.2

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本文編號(hào)：2659066