【摘要】：世界各地均有進(jìn)食蘑菇而引發(fā)中毒的報(bào)告。在我國(guó),毒蘑菇中毒所致死亡人數(shù)和其病死率均居食物中毒的首位。在蘑菇中毒中,高達(dá)90%的死亡是由含鵝膏肽類毒素的蘑菇引起。近年,在含鵝膏肽類毒素的蘑菇識(shí)別取得了較大進(jìn)展,研究發(fā)現(xiàn),我國(guó)含鵝膏肽類毒素的蘑菇的種類與歐美有較大差別,其中致命鵝膏作為我國(guó)特有的鵝膏屬蘑菇種類,在2000-2014年,僅明確診斷的事件就有25起,導(dǎo)致至少99人中毒,48人死亡。此種導(dǎo)致的中毒事件2000年首次在廣東報(bào)道,目前尚未有致命鵝膏完整病例報(bào)道,缺乏致命鵝膏中毒臨床特征數(shù)據(jù);在含鵝膏肽類毒素的蘑菇中毒治療方面,尚無(wú)特效解毒劑,臨床常用的治療手段包括洗胃、口服活性炭、利尿劑使用、膽汁引流和血液凈化技術(shù)等方法,試圖通過(guò)改變鵝膏肽類毒素在體內(nèi)毒代動(dòng)力學(xué)過(guò)程來(lái)達(dá)到治療目的,但由于缺乏臨床實(shí)踐中可用暴露標(biāo)志物,無(wú)合適的動(dòng)物模型,鵝膏肽類毒素在血液中動(dòng)態(tài)變化過(guò)程和排泄特征不完全清楚,臨床干預(yù)缺乏理論基礎(chǔ)。鑒于此,我們從以下兩方面進(jìn)行研究(1)通過(guò)開展蘑菇中毒事件調(diào)查,收集致命鵝膏中毒病例,探討我國(guó)含鵝膏肽類毒素蘑菇致中毒性肝損害的臨床特點(diǎn);(2)通過(guò)建立致命鵝膏致比格犬中毒肝損害模型及比格犬長(zhǎng)期膽汁引流模型,描述三種鵝膏肽類毒素在比格犬血液中動(dòng)態(tài)變化和排泄過(guò)程,計(jì)算三種鵝膏肽類毒素的毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù),尋找三種鵝膏肽類毒素排泄規(guī)律,為臨床毒素清除治療提供理論依據(jù)。第一部分致命鵝膏中毒臨床特征研究目的:調(diào)查致命鵝膏中毒事件,收集致命鵝膏中毒病例,探討我國(guó)含鵝膏肽類毒素蘑菇致中毒性肝損害臨床特點(diǎn)。方法:2014-2015年,在云南對(duì)三起致命鵝膏中毒事件進(jìn)行調(diào)查,共收集10例致命鵝膏中毒病例,采集三起中毒事件蘑菇標(biāo)本5份,采集病例血液樣本25份,尿液樣本5份。應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)事件中5份蘑菇標(biāo)本進(jìn)行鑒定;應(yīng)用UPLC-ESI-MS-MS方法對(duì)致命鵝膏子實(shí)體、中毒病例血液和尿液樣本進(jìn)行5種鵝膏肽類毒素檢測(cè);通過(guò)查閱病歷,整理分析中毒病例一般人口學(xué)信息、蘑菇攝入量、臨床表現(xiàn),實(shí)驗(yàn)室檢查和治療情況等信息。結(jié)果:三起事件收集到的蘑菇經(jīng)形態(tài)學(xué)、ITS序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為鵝膏屬檐托鵝膏組中的致命鵝膏。致命鵝膏不同部位鵝膏肽類毒素含量由高到低依次為菌蓋、菌柄、菌托;致命鵝膏中不同種類毒素含量由高到低依次為α-amanitin、Phallacidin、β-amanitin和γ-amanitin。10例致命鵝膏中毒病例從食入蘑菇到出現(xiàn)中毒表現(xiàn)的平均時(shí)間為13.9 + 2.1 h,從食入蘑菇到入院的平均時(shí)間為49.6 + 8.5 h。致命鵝膏中毒的最常見首發(fā)癥狀為嘔吐和腹瀉(發(fā)生率100%)。4例患者死于肝功能衰竭,6例患者康復(fù)后出院。食入致命鵝膏后2d,患者ALT、AST、TBIL、DBIL、PT 和 APTT 水平出現(xiàn)明顯升高(ALT 653.3 U/L;AST 509.8 U/L;TBIL 43.9 μmol/L;DBIL 23.1 μmol/L;PT 23.7 s;APTT 43.8 s);食入蘑菇后 3d,患者 ALT、AST、PT 和 APTT 水平達(dá)到峰值(ALT 1018.6 U/L;AST 903.4 U/L;PT49.8 s;APTT 79.8 s);食入蘑菇后7 d,患者TBIL和DBIL水平達(dá)到峰值(TBIL 88.8μmol/L;DBIL83μmol/L);指標(biāo)達(dá)峰后,患者 ALT、AST、TBIL、DBIL、PT和APTT水平逐漸下降,在食入蘑菇后14 d恢復(fù)至正常水平。將中毒病例分為死亡組病例和存活組病例分析發(fā)現(xiàn),兩組病例ALT、AST、TBIL、DBIL、PT和APTT指標(biāo)變化趨勢(shì)相同,但死亡組病例各個(gè)指標(biāo)升高幅度更大。食入致命鵝膏48h后,中毒病例血液中無(wú)法檢測(cè)到鵝膏肽類毒素;食入致命鵝膏96h內(nèi),部分中毒患者尿液中可檢測(cè)到鵝膏肽類毒素。結(jié)論:致命鵝膏主要在亞熱帶地區(qū)雨季生長(zhǎng),是世界上毒性最大的蘑菇種類之一。致命鵝膏中毒病例以長(zhǎng)潛伏期(6-24h)、前期胃腸炎癥狀和后期肝損害表現(xiàn)為特點(diǎn)。病例食入致命鵝膏48 h內(nèi)的血液和96 h內(nèi)的尿液樣本中鵝膏肽類毒素檢測(cè)具有診斷價(jià)值。第二部分鵝膏肽類毒素在比格犬體內(nèi)毒代動(dòng)力學(xué)初步研究2.1比格犬致命鵝膏中毒肝損害模型及長(zhǎng)期膽汁引流模型建立目的:通過(guò)建立致命鵝膏致比格犬中毒肝損害模型,為含鵝膏肽類毒素蘑菇中毒的診斷和治療等相關(guān)研究打下基礎(chǔ);通過(guò)建立比格犬長(zhǎng)期膽汁引流模型,為含鵝膏肽類毒素蘑菇中毒在內(nèi)的膽汁相關(guān)疾病提供研究手段。方法:將12只健康雄性比格犬隨機(jī)分入60mg/kg致命鵝膏組和膽汁引流組,每組6只。60 mg/kg致命鵝膏組用于建立比格犬致命鵝膏中毒肝損害模型,膽汁引流組用于建立比格犬長(zhǎng)期膽汁引流模型。60mg/kg致命鵝膏組中,UPLC-ESI-MS-MS法測(cè)定致命鵝膏干粉中鵝膏肽類毒素含量,膠囊喂飼比格犬60 mg/kg致命鵝膏干粉,觀察其中毒表現(xiàn)及死亡情況,通過(guò)檢測(cè)凝血及肝腎功能、肝臟病理以及血漿和尿液中鵝膏肽類毒素含量,用于比格犬致命鵝膏中毒肝損害模型觀測(cè)指標(biāo);對(duì)膽汁引流組中比格犬進(jìn)行膽總管結(jié)扎膽囊穿刺引流術(shù),術(shù)后犬穿戴上內(nèi)部保護(hù)衣、外部保護(hù)衣、胸帶、伊麗莎白項(xiàng)圈后,將引流袋放入外部保護(hù)衣背包。術(shù)后每日觀察比格犬手術(shù)切口及一般狀況,觀察膽汁性質(zhì)并記錄每日引流量,使用犬代謝籠收集并記錄每日尿量,同時(shí)測(cè)定比格犬術(shù)后凝血及肝功能指標(biāo)變化情況,術(shù)后28d處死膽汁引流組中比格犬,并取肝臟組織進(jìn)行病理檢查。結(jié)果:本研究所用致命鵝膏干粉中鵝膏肽類毒素總含量為3482.6± 124.94 mg/kg。比格犬致命鵝膏中毒肝損害模型犬在12-48h出現(xiàn)嘔吐和腹瀉等癥狀,染毒24h,模型犬ALT、AST、TBIL、ALP、PT和APTT水平出現(xiàn)明顯升高,染毒后36h,ALT、AST、PT和APTT水平達(dá)到峰值(ALT:283.2卡門氏單位;AST:125.6卡門氏單位;PT:132.9 s;APTT:131.4 s),染毒后48 h,TBIL和ALP值達(dá)到峰值(TBIL:23.3 μmol/L;ALP:274.5U/L),模型犬 TBIL、TP 和 APTT 在染毒后1周恢復(fù)至正常水平,ALT、AST和ALP在染毒后3周恢復(fù)至正常水平。染毒后24-72h死亡3只,肝臟病理檢查顯示彌漫性肝細(xì)胞出血性壞死。染毒后24h內(nèi),血漿中可檢測(cè)到鵝膏肽類毒素;染毒后92 h內(nèi),尿液中可檢測(cè)到鵝膏肽類毒素。膽汁引流組中比格犬在術(shù)后一周手術(shù)切口愈合,拆線,術(shù)后2天內(nèi)精神不振,食欲下降,活動(dòng)減少,術(shù)后第4d基本正常。比格犬膽汁引流術(shù)后第Id、2d和3d的ALT、AST和ALP指標(biāo),與術(shù)前比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均小于0.05),出現(xiàn)輕微升高(升高幅度均在術(shù)前一倍以內(nèi)),并在一周后恢復(fù)至正常水平。比格犬膽汁引流術(shù)不同時(shí)間點(diǎn)TBIL、DBIL、PT、APTT、BUN和CRE指標(biāo),與術(shù)前比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。術(shù)后28 d比格犬肝臟未出現(xiàn)明顯病理改變。膽汁引流組比格犬每日尿量為250.4±19.1 mL/d,每日膽汁引流量為69.9±6.1 mL。結(jié)論:致命鵝膏可引起肝細(xì)胞出血性壞死,導(dǎo)致急性肝功能衰竭,該模型符合含鵝膏肽類毒素蘑菇致中毒性肝功能損害的臨床病理生理特點(diǎn)和鵝膏肽類毒素在血液和尿液中的檢出時(shí)限,可應(yīng)用于含鵝膏肽類毒素蘑菇中毒的診斷和治療相關(guān)研究;比格犬長(zhǎng)期膽汁引流模型可在犬正常生理活動(dòng)狀態(tài)下長(zhǎng)期(至少28 d)監(jiān)測(cè)膽汁排泄情況,可應(yīng)用于鵝膏肽類毒素膽汁排泄及其它膽汁相關(guān)疾病的研究。2.2鵝膏肽類毒素在比格犬血液中動(dòng)態(tài)變化及排泄研究目的:描述三種鵝膏肽類毒素在比格犬血液中動(dòng)態(tài)變化和排泄過(guò)程,計(jì)算三種鵝膏肽類毒素的毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù),尋找三種鵝膏肽類毒素排泄規(guī)律,探討膽汁引流在鵝膏肽類毒素蘑菇中毒過(guò)程中的作用,為臨床毒素清除治療提供理論依據(jù)。方法:36只雄性比格犬分隨機(jī)分為空白對(duì)照組、膽汁引流組、20mg/kg致命鵝膏組、20mg/kg膽汁引流組、60mg/kg致命鵝膏組和60mg/kg膽汁引流組,每組6只。20 mg/kg膽汁引流組和60 mg/kg膽汁引流組中比格犬在接受膽總管結(jié)扎膽囊穿刺膽汁引流手術(shù)后第7 d經(jīng)口膠囊喂飼20 mg/kg和60 mg/kg致命鵝膏干粉�？瞻讓�(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組比格犬喂飼空膠囊。觀察其各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中比格犬中毒表現(xiàn)及死亡情況,通過(guò)檢測(cè)凝血及肝腎功能、肝臟病理進(jìn)行毒效學(xué)研究。應(yīng)用UPLC-ESI-MS-MS法測(cè)定致命鵝膏干粉中及染毒后不同時(shí)間點(diǎn)比格犬血液、尿液、膽汁及糞便中三種鵝膏肽類毒素含量,計(jì)算鵝膏肽類毒素毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和排泄量。通過(guò)比較膽汁引流組和非膽汁引流組之間鵝膏肽類毒素毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和排泄量之間的差異,分析膽汁引流在鵝膏肽類毒素蘑菇中毒過(guò)程中的作用。結(jié)果:空白對(duì)照組、膽汁引流組和20mg/kg膽汁引流組中,所有比格犬均未出現(xiàn)任何中毒表現(xiàn)及死亡發(fā)生。染毒后12-48 h,20 mg/kg致命鵝膏組、60 mg/kg致命鵝膏組和60 mg/kg膽汁引流組中,分別有33.3%、100%和50%比格犬出現(xiàn)嘔吐和腹瀉。60 mg/kg致命鵝膏組中3只比格犬因肝衰竭死亡,其它各實(shí)驗(yàn)組中比格犬無(wú)死亡發(fā)生。20 mg/kg致命鵝膏組和60 mg/kg致命鵝膏組中,染毒后24 h,比格犬ALT、AST、TBIL、ALP、PT、APTT和INR水平出現(xiàn)明顯升高;染毒后 36h,ALT,AST,PT、APTT 和 INR 達(dá)到峰值;染毒后 48h,TBIL 和 ALP值達(dá)到峰值;達(dá)到峰值后,存活比格犬TBIL、DBIL、PT、APTT和INR水平在染毒后1周恢復(fù)至正常水平,其ALT、AST和ALP水平在染毒后3周恢復(fù)至正常水平。試驗(yàn)期間動(dòng)物BUN和CRE水平正常。在相同染毒劑量下,膽汁引流組與非膽汁引流組相比,凝血及肝腎功能指標(biāo)具有相似的變化規(guī)律,但升高幅度更大。60 mg/kg致命鵝膏組中比格犬肝臟病理檢查發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞出血性壞死,其它各實(shí)驗(yàn)組中比格犬肝臟未見明顯病理改變。三種鵝膏肽類毒素的主要毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下:Tmax在1.25-2.08 h之間,MRT在1.95-3.82 h之間,消除半衰期T1/2在0.54-1.94h 之間,CLs在 0.12-0.54 L/h/kg 之間,α-Amanitin 和 β-Amanitin 的表觀分布容積Vz/F在0.04-0.12 L/kg,Phallacidin的表觀分布容積Vz/F為0.43 L/kg。尿中三種鵝膏肽類毒素0-2 d排泄量占尿中排泄總量90%以上,比格犬0-1 d糞便中三種鵝膏肽類毒素排泄量占糞便中總排泄量的90%以上,三種鵝膏肽類毒素的膽汁排泄量占尿液和膽汁排泄總量的比例小于20%;在相同外暴露劑量下,膽汁引流組與非膽汁引流組相比,中毒表現(xiàn)和病理?yè)p傷更輕、血生化水平升高幅度更小、血、尿中毒素含量更低,糞便中毒素排出量更高。結(jié)論:三種鵝膏肽類毒素經(jīng)胃腸道吸收迅速,在血液中清除迅速,三種鵝膏肽類毒素在食入含有鵝膏肽類毒素蘑菇后48 h內(nèi)血液中可檢測(cè)到鵝膏肽類毒素,提示在中毒后2d內(nèi)采取血液凈化技術(shù),可能達(dá)到清除毒素的效果;α-Amanitin和β-Amanitin主要分布在細(xì)胞外液中,Phallacidin在體內(nèi)分布更廣泛;鵝膏肽類毒素的膽汁排泄量占尿液和膽汁排泄總量的比例小于20%,但膽汁中毒素來(lái)源于肝細(xì)胞,這部分毒素是起到肝毒性作用劑量,尚不能判斷膽汁引流是否有效;膽汁在鵝膏肽類毒素的腸道吸收過(guò)程中起到促進(jìn)作用,但機(jī)制尚不清楚。
【圖文】：

逑ＥＨＩ逡逑圖１－２．致命鵝膏子實(shí)體（Ａ）來(lái)源于騰沖中毒現(xiàn)場(chǎng)（Ｂ）來(lái)源于楚雄中毒現(xiàn)逡逑場(chǎng)逡逑？邐Ｖ邋：邋＼：邋．；；；■＇邋■；邋■邋Ｗ．邋＂逡逑？邐Ｖ邋？？逡逑ｍｍ逡逑ｗ＾＼邐廣邋＊逡逑圖１－３．致命鵝膏１００倍顯微鏡下照片（Ａ）致命鵝膏擔(dān)孢子，棉蘭染色（Ｂ）致逡逑命鵝膏擔(dān)子，５％邋ＫＯＨ。注：致命鵝膏具有特征性的是白色子實(shí)體和擔(dān)子具有兩逡逑小梗。逡逑１．３．１．２分子生物學(xué)鑒定逡逑將中毒事件樣本中的蘑菇的ＩＴＳ序列在ＧｅｎＢａｎｋ中比對(duì)，結(jié)果為致命鵝膏逡逑（見表１－４）。基于ＩＴＳ序列構(gòu)建的致命鵝膏系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，致命鵝膏和其它文逡逑獻(xiàn)中報(bào)道的含鵝膏肽類毒素的鵝膏屬蘑菇聚集在檐托鵝膏組（詳見圖１邋３）。逡逑３１逡逑

ｗ＾＼邐廣邋＊逡逑圖１－３．致命鵝膏１００倍顯微鏡下照片（Ａ）致命鵝膏擔(dān)孢子，棉蘭染色（Ｂ）致逡逑命鵝膏擔(dān)子，，５％邋ＫＯＨ。注：致命鵝膏具有特征性的是白色子實(shí)體和擔(dān)子具有兩逡逑小梗。逡逑１．３．１．２分子生物學(xué)鑒定逡逑將中毒事件樣本中的蘑菇的ＩＴＳ序列在ＧｅｎＢａｎｋ中比對(duì)，結(jié)果為致命鵝膏逡逑（見表１－４）�；冢桑裕有蛄袠�(gòu)建的致命鵝膏系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，致命鵝膏和其它文逡逑獻(xiàn)中報(bào)道的含鵝膏肽類毒素的鵝膏屬蘑菇聚集在檐托鵝膏組（詳見圖１邋３）。逡逑３１逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R595.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王晶;史振霞;喬潔;侯曉強(qiáng);吳智艷;韓美玲;;毒鵝膏菌和鵝膏肽類毒素研究進(jìn)展[J];廊坊師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2018年01期

2 陳作紅,張志光;蘑菇毒素及其中毒治療(Ⅰ)——鵝膏肽類毒素[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2003年02期

3 柳潔;黃海燕;曾灼祥;陳效;肖嘉慧;王楊燕;;大鼠血清和尿液中4種鵝膏肽類毒素代謝特征的超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2018年16期

4 柳潔;曾灼祥;肖嘉慧;;血清和尿液中4種鵝膏肽類毒素的UPLC-ESI-Q-TOF分析[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2017年23期

5 胡勁松;陳作紅;;大孔吸附樹脂聯(lián)合葡聚糖凝膠Sephadex LH20分離制備鵝膏肽類毒素的研究[J];菌物學(xué)報(bào);2014年03期

6 柳潔;丁文婕;何碧英;羅蘭;黃薔;;超高效液相色譜-電噴霧離子化-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜指紋圖譜檢測(cè)毒蕈中4種鵝膏肽類毒素[J];分析化學(xué);2013年04期

7 張紫萍;凌漢新;劉青;武大林;;水飛薊煎劑治療急性鵝膏肽類毒素致肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J];今日藥學(xué);2014年01期

8 高國(guó)賦;曾華;陳作紅;;Amanin的制備與活性檢測(cè)[J];湖南農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年07期

9 李啟;雷永良;宋瑞強(qiáng);梅少林;章豪;;鵝膏肽類毒素質(zhì)譜檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2015年11期

10 陳作紅,李海燕,魏寶陽(yáng);德陽(yáng)市81例蘑菇中毒事件調(diào)查及其分析[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2005年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 孫健;致命鵝膏肝毒性及鵝膏肽類毒素在比格犬體內(nèi)毒代動(dòng)力學(xué)初步研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2018年

2 張爍;鵝膏肽類毒素檢測(cè)方法建立及其在鵝膏菌屬中分布研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 廖瓊;鵝膏肽類毒素的毒理及靈芝對(duì)其所致肝損傷的保護(hù)作用研究[D];湖南師范大學(xué);2009年

2 任荊蕾;非鵝膏屬真菌中鵝膏肽類毒素分布與系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 魏佳會(huì);鵝膏菌毒素的分離、鑒定及生物樣本中的定量分析[D];錦州醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2644247