【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一種在全球范圍內(nèi)分布的具有感染性的人類(lèi)病原體,尤其在撒哈拉以南的非洲、太平洋地區(qū),特別是亞洲高度流行。生活在慢性高HBV患病率地區(qū)的人口占到全球人口的45%,其已經(jīng)感染的人口達(dá)到4億,使得HBV成為常見(jiàn)的人類(lèi)病原體,嚴(yán)重影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。HBV是嗜肝DNA病毒家族的一員,其慢性感染(Chronic HBV,CHB)會(huì)引起多種肝病,包括無(wú)癥狀HBV攜帶者(Asymptomatic HBV Carrier,ASC)、慢性肝炎(Chronic Hepatitis,CH)、肝硬化(Liver Cirrhosis,LC)和肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)等。在HBV感染的急性和慢性肝病患者中觀察到多種肝外臨床表現(xiàn),腎功能紊亂仍是最常見(jiàn)的肝外臨床表現(xiàn)。這種由于乙肝病毒感染導(dǎo)致的腎病稱(chēng)為乙型肝炎病毒相關(guān)性腎小球炎(HBV-associated Glomerulonephritis,HBV-GN),其可能的致病機(jī)制假說(shuō)包括:HBV抗原(HBAg)和抗體(HBAb)免疫復(fù)合物結(jié)合所介導(dǎo)的典型免疫復(fù)合物腎小球腎炎;第二種宿主和病毒遺傳因子所致的機(jī)體免疫功能缺陷,進(jìn)而導(dǎo)致腎炎;自身免疫影響;以及病毒直接效應(yīng)作用腎臟器官這幾種原因?qū)е履I臟炎癥發(fā)生。通過(guò)原位雜交、陽(yáng)性信號(hào)定位和Southern都能夠在HBV-GN患者的腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞的胞核中檢測(cè)到陽(yáng)性HBV-DNA,證明機(jī)體存在病毒直接效應(yīng)機(jī)制。但HBs(Hepatitis B s)直接作用腎臟后致腎病的研究少,分子機(jī)制不明。本課題利用HBs基因穩(wěn)轉(zhuǎn)小鼠(Mus musculus)模型,借助TMT標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、利用加權(quán)共表達(dá)等生物信息學(xué)方法系統(tǒng)性分析探究HBs可能的致病機(jī)制。分別取6個(gè)月、12個(gè)月齡的野生型(Wild-type,WT)對(duì)照小鼠和HBs轉(zhuǎn)基因小鼠(Transgenic,Tg)腎組織作為樣本進(jìn)行TMT標(biāo)記。以6個(gè)月野生型小鼠(6m_WT)作為生物學(xué)重復(fù),所有樣品等量混合后進(jìn)行離線液相色譜分離,再進(jìn)行LC-MS大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定和定量,以觀察HBs的致病機(jī)制以及隨著感染變化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)組學(xué)差異。我們共鑒定5127個(gè)蛋白,二級(jí)譜圖總數(shù)為665687張;二級(jí)譜圖解析率為23.4%;其中雙肽段以上占比超過(guò)85%。加權(quán)共表達(dá)分析網(wǎng)絡(luò)(Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)利用Pearson計(jì)算兩兩蛋白間的相關(guān)性系數(shù),將相關(guān)性高的蛋白聚集到一起,定義為一個(gè)模塊。將分類(lèi)變量,野生型/轉(zhuǎn)基因樣品,分別轉(zhuǎn)化為數(shù)值變量(0/1)導(dǎo)入計(jì)算。借助加權(quán)共表達(dá)分析網(wǎng)絡(luò)算法將差異蛋白劃分為棕色、綠色和藍(lán)色三個(gè)模塊。再將模塊與是否為轉(zhuǎn)基因感染表型聯(lián)系起來(lái)進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)綠色模塊與表型顯著性相關(guān)。其中與表型顯著性相關(guān)的差異蛋白有127個(gè)。進(jìn)一步將差異蛋白和HBs轉(zhuǎn)基因鼠隨時(shí)間變化進(jìn)行聚類(lèi),可分成4種類(lèi)型。利用Metascape、IPA和Reactome對(duì)所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白進(jìn)行生物反應(yīng)富集分析,發(fā)現(xiàn)HBs轉(zhuǎn)基因致腎病的三種可能機(jī)制。(1)HBs介導(dǎo)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)(Solute Carrie,SLC)相關(guān)蛋白的統(tǒng)一下調(diào),引起腎臟的損傷;(2)HBs作為免疫原激活腎臟補(bǔ)體反應(yīng),進(jìn)而介導(dǎo)腎臟的炎癥通路;(3)HBs表達(dá)引發(fā)細(xì)胞凋亡,釋放細(xì)胞色素,進(jìn)而介導(dǎo)PPAR通路和炎癥通路的異常。不僅如此,我們還發(fā)現(xiàn)5個(gè)隨HBs感染時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)高表達(dá)的蛋白FABP1、PNKD、ECI3、PRL15和HACL1。已知核糖體蛋白質(zhì)L15(PRL15)的高表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖;而肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(Liver-type fatty acid-binding protein,L-FABP或FABP1)與慢性腎病發(fā)展有關(guān),可作為腎小管間質(zhì)損傷敏感的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
【圖文】：

圖 2-1 探究 HBs 感染腎臟分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)組學(xué)定量數(shù)據(jù)質(zhì)控分析表 2-3 質(zhì)控結(jié)果分析，本實(shí)驗(yàn)鑒定二級(jí)譜圖總數(shù)為 665687 張；二級(jí)譜圖解。總鑒定蛋白量為 5127，蛋白對(duì)應(yīng)的唯一性肽段 (Unique Peptides) 總鑒全酶切率為 86.1%，TMT 的標(biāo)記效率為 93.7%。表 2-3 蛋白質(zhì)控檢測(cè)分析結(jié)果體肽段和蛋白分布情況如圖 2-2 所示，鑒定到肽段長(zhǎng)度分布于 7~20 個(gè)氨的比例超過(guò) 95%，符合肽酶酶解的規(guī)律。其次每個(gè)蛋白鑒定的肽段大于達(dá)到 87.3%。而每個(gè)蛋白鑒定到的特異性肽段至少為 2 的比例高達(dá) 85%鑒定的蛋白質(zhì)具有良好的肽覆蓋度，蛋白質(zhì)的序列覆蓋度超過(guò) 10％，，所

河北大學(xué)碩士學(xué)位論文本一致，豐度的動(dòng)態(tài)范圍處于 102~108之間，數(shù)據(jù)跨域了 6~7 個(gè)數(shù)量級(jí)，強(qiáng)度動(dòng)態(tài)范圍跨度大。從蛋白和肽段分布等方面的質(zhì)量控制結(jié)果表征了 TMT 標(biāo)記定量的準(zhǔn)確性；說(shuō)明了質(zhì)譜儀器的靈敏，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R692.3;R512.62

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本文編號(hào)：2624007