【摘要】：目的:研究鑒定分枝桿菌細胞壁脂質(zhì)PDIM誘導Gal-3表達的TLR信號通路,明確Gal-3對PDIM調(diào)控炎癥介質(zhì)釋放的影響及其機制;并進一步研究Gal-3對PDIM介導肉芽腫形成的意義與機制。方法:將Raw264.7細胞分為正常對照組(Mock)、WT野生株和PDIM缺失突變株(命名為△PDIM)感染組。(1)Western blot檢測各感染組0.5-4 h內(nèi)Gal-3蛋白表達,qRT-PCR檢測Gal-3 mRNA表達,細胞免疫熒光檢測各組感染4 h時Gal-3蛋白表達強度,并統(tǒng)計比較各感染組不同時間點胞內(nèi)菌數(shù)量,明確PDIM誘導Gal-3蛋白表達與侵入胞內(nèi)的細菌數(shù)量無關(guān)。(2)Western blot和qRT-PCR分別檢測各感染組0.5-4 h內(nèi)TLR2和TLR4蛋白與mRNA表達變化;并分別使用TLR2受體特異性抑制劑(C29)和NF-κB特異性轉(zhuǎn)錄活性抑制劑(JSH-23)預處理細胞,western blot和qRT-PCR分別比較各感染組0.5-4 h Gal-3蛋白和mRNA表達,初步明確PDIM誘導Gal-3表達的TLR信號通路。(3)各組感染4 h時,qRT-PCR檢測TNF-α、IL-6、iNOS、IL-10和TGF-β表達,western blot檢測各感染組0.5-4 h內(nèi)ERK、NF-κBp65和IKK總蛋白及其磷酸化水平,confocal觀察Gal-3與NF-κBp65的共定位情況,免疫共沉淀(Co-IP)檢測Gal-3與NF-κBp65之間的相互作用。(4)轉(zhuǎn)染Gal-3的siRNA干擾質(zhì)粒到Raw264.7細胞,再感染W(wǎng)T和△PDIM菌株4 h,qRT-PCR檢測各感染組TNF-α、IL-6、iNOS、IL-10和TGF-β表達,confocal檢測各感染組中Gal-3與NF-κBp65的胞內(nèi)表達及定位情況。(5)構(gòu)建Gal-3過表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染Raw264.7細胞,再感染△PDIM菌株4 h,qRT-PCR檢測TNF-α、iNOS和TGF-β表達,confocal檢測Gal-3表達以及NF-κBp65入核情況,明確PDIM誘導Gal-3對NF-κB活化及下游炎癥相關(guān)因子表達變化影響。(6)建立海分枝桿菌小鼠尾靜脈感染模型,然后再注射Gal-3特異性抑制劑TD139,比較大體病變和計算病變面積,組織勻漿鋪板計數(shù)載菌量,HE染色和抗酸染色觀察小鼠尾部組織病理變化及細菌分布,免疫組化染色和圖像分析技術(shù)檢測小鼠組織中Gal-3、TNF-α和MMP-9蛋白表達與分布,明確TD139對小鼠組織損傷的干預效應(yīng)。結(jié)果:(1)海分枝桿菌感染小鼠Raw264.7巨噬細胞后,WT感染組中Gal-3蛋白和mRNA均呈上升趨勢;細菌侵染實驗發(fā)現(xiàn),含有PDIM的WT菌株誘導Gal-3表達與侵入Raw264.7細胞內(nèi)的細菌數(shù)無關(guān)。(2)相比于△PDIM感染組,WT感染組中TLR2蛋白和mRNA表達逐漸升高,而兩組中TLR4蛋白和mRNA表達均降低;使用TLR2受體特異性抑制劑(C29)和NF-κB特異性轉(zhuǎn)錄活性抑制劑(JSH-23)預處理細胞后,WT感染組中Gal-3蛋白和mRNA表達明顯降低,提示PDIM可能通過TLR2/NF-κB通路誘導Gal-3表達。(3)感染4 h后,相比于WT感染組,△PDIM感染組中促炎因子TNF-α、IL-6和iNOS表達顯著升高,而抑炎因子IL-10和TGF-β表達降低,且差異顯著。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)WT感染組中ERK、NF-κBp65和IKK蛋白的磷酸化水平較低,而△PDIM感染組中ERK、NF-κBp65和IKK蛋白則是持續(xù)磷酸化狀態(tài),表明PDIM可抑制宿主細胞早期免疫反應(yīng)。Confocal觀察發(fā)現(xiàn)Gal-3和NF-κBp65存在明顯共定位,并且Co-IP證實兩者之間存在較強的相互作用,說明PDIM誘導Gal-3可抑制NF-κB活化及下游炎癥相關(guān)因子表達。(4)轉(zhuǎn)染Gal-3的siRNA干擾質(zhì)粒到Raw264.7細胞后,能完全逆轉(zhuǎn)WT感染組中促炎因子和抑炎因子的表達趨勢,并且顯著增加NF-κBp65入核活化率。(5)轉(zhuǎn)染Gal-3過表達質(zhì)粒到Raw264.7細胞后,也能逆轉(zhuǎn)△PDIM感染組中炎癥介質(zhì)表達,并且顯著降低NF-κBp65入核活化率(6)小鼠尾靜脈感染模型中,WT感染組小鼠尾部出現(xiàn)明顯腫脹、潰爛,組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)有典型肉芽腫病變,并檢測到大量細菌,TNF-α和MMP-9表達呈強陽性;給予WT感染組小鼠注射TD139干預后,小鼠尾部病變得到明顯改善,TNF-α和MMP-9炎性介質(zhì)表達減少;而△PDIM感染組小鼠尾部有輕微腫脹,僅檢測到少許細菌。結(jié)論:分枝桿菌細胞壁脂質(zhì)PDIM可能通過TLR2/NF-κB通路誘導Gal-3表達,Gal-3負反饋于NF-κB信號通路并抑制TNF-α和IL-6等促炎因子表達,幫助細菌逃避宿主早期免疫殺傷;動物感染實驗中Gal-3可促進TNF-α和MMP-9分泌并介導組織損傷及肉芽腫形成。
【圖文】：

2 分枝桿菌細胞壁脂質(zhì) PDIM 對 Raw264.7 細胞 TLR2 和 TLR4 表達的的影響（n注：與 WT 感染組比較，*P<0.05，**P<0.01，NS 無統(tǒng)計學意義 TLR2 特異性抑制劑（C29）和 NF-κ' 轉(zhuǎn)錄活性特異性抑制劑（Jal-3 表達的影響果如圖 3 所示，使用 C29（200μ2）和 JSH-23（20μ2）預處理細胞，孵育細胞。A 圖 western blot 結(jié)果顯示，相較于正常感染組，使用 C29 和胞后，WT 感染組中 Gal-3 蛋白表達均呈逐漸下降趨勢。B 圖 qRT-PCR用 C29 和 JSH-23 處理細胞后，WT 感染組中 Gal-3 mRNA 的表達也明顯

圖3 TLR2受體抑制劑（C29）和NF-κB活性抑制劑（JSH-23）對Gal-3蛋白表達的影響（n=3注：與 WT 感染組比較，*P<0.05，**P<0.01，NS 無統(tǒng)計學意義.1.4 分枝桿菌細胞壁脂質(zhì) PDIM 對 NF-κ' 信號活化及炎癥相關(guān)因子表影響結(jié)果如圖 4 所示，A 圖為 qRT-PCR 檢測細菌感染細胞 4 h 后 TNF-α、IL-6、iNOSL-10 和 TGF-β 表達變化，△PDIM 感染組促炎因子相比于 WT 感染組顯著升P<0.05）；WT 感染組較△PDIM 感染組抑炎因子顯著升高（P<0.05），且與 Mo無差異，而抑炎因子均升高（P<0.05）。B 圖為 western blot 檢測細菌感染細胞 0.5，，ERK、NF-κ'p 和 IKK 蛋白及其磷酸化變化，相比于△PDIM 感染組，WT 感中 Phospho-ERk 蛋白降低較快，NF-κ'p 和 IKK 磷酸化蛋白呈先升高后降低， 4 h 降低最明顯，而△PDIM 感染組中 NF-κ'p 和 KK 蛋白呈持續(xù)磷酸化狀態(tài)。
【學位授予單位】：三峽大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R52

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本文編號：2621993