【摘要】：目的:研究布魯菌病患者和小鼠模型中T淋巴細(xì)胞亞群及其PD-1的表達(dá)變化及相關(guān)性,探討布魯菌感染機(jī)體后的免疫應(yīng)答特征對疾病進(jìn)展、預(yù)后的影響,為今后臨床對布魯菌病更有效的診斷和治療提供思路。方法:(1)通過Meta分析對我國布魯菌病患者的臨床表現(xiàn)、并發(fā)癥、誤診率和實驗室檢查進(jìn)行了系統(tǒng)分析;同時還對國內(nèi)外有關(guān)布魯菌病患者外周血中T淋巴細(xì)胞比例變化的文獻(xiàn)進(jìn)行了Meta分析。(2)對在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的不同分期(急性、慢性及恢復(fù)期)的患者和健康對照進(jìn)行分組,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中T淋巴細(xì)胞亞群和PD-1的表達(dá)水平,采用流式液相多重蛋白定量技術(shù)檢測患者血清中T淋巴細(xì)胞因子的表達(dá)量,進(jìn)行統(tǒng)計分析各項指標(biāo)在不同分組間表達(dá)的差異及相關(guān)性。(3)使用布魯菌標(biāo)準(zhǔn)毒株16M通過腹腔注射法建立BALB/c小鼠感染布魯菌的動物模型,將小鼠分為三組:正常對照組,布魯菌感染模型組(Brucella),PD-1抗體干預(yù)組(Brucella+PD-1Ab),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠不同感染階段PD-1在CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表面的表達(dá);采用流式液相多重蛋白定量技術(shù)的方法檢測不同感染時期小鼠T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平;采用HE染色觀察小鼠感染后肝臟的病理,分析布魯菌感染狀態(tài)下PD-1對T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控以及靶器官炎癥損傷發(fā)生的影響。結(jié)果:(1)關(guān)于我國布魯菌病患者臨床特征的Meta分析一共納入68篇文獻(xiàn),共計報道了12842例患者,男女患者比例為(2.64∶1),79.4%的患者有明確接觸史,我國布魯菌病最常見的臨床癥狀是發(fā)熱、疲勞、關(guān)節(jié)痛、出汗和肌肉疼痛。布魯菌病患者會出現(xiàn)合并伴骨關(guān)節(jié)炎、肝炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙、心血管疾病、呼吸道癥狀、睪丸炎或附睪炎、噬血細(xì)胞綜合征等并發(fā)癥。與成人患者相比,兒童患者皮疹和呼吸系統(tǒng)、心臟、睪丸炎、附睪炎等并發(fā)癥的發(fā)生率較高。寒戰(zhàn)、頭痛和體重下降的發(fā)病率較成人低。62.5%的患者在首次就診時發(fā)生誤診。常見的異常實驗室結(jié)果為白細(xì)胞減少,其他還有貧血、血小板減少、全血細(xì)胞減少以及白細(xì)胞增多。(2)患者外周血中T淋巴細(xì)胞比例變化的Meta分析共納入了8個研究,包括患者396例,健康對照212例。結(jié)果顯示患者CD4+T細(xì)胞比例和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值低于健康對照組(P0.05),CD8+T細(xì)胞比例在患者組高于健康對照組(P0.05)。(3)本研究共收集了住院及門診的125例布魯菌感染患者病史及外周血標(biāo)本,其中急性期患者47例、慢性期患者43例、恢復(fù)期患者35例,以及30名健康志愿者。急性期布魯菌患者CD4+T和CD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)率高于慢性期、恢復(fù)期患者和健康對照(P0.05),其在慢性期患者中的表達(dá)要高于恢復(fù)期患者和健康對照(P0.05)。Th1細(xì)胞在急性期患者外周血中比例高于慢性期患者、恢復(fù)期患者和健康對照(P0.05)。慢性期患者中Th1的細(xì)胞比例要高于恢復(fù)期患者和健康對照(P0.05),恢復(fù)期患者停藥1年以內(nèi)Th1細(xì)胞比例仍高于健康對照(P0.05)。Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子IL-2在急性期及恢復(fù)期患者中表達(dá)高于健康對照(P0.05),IFN-γ在急性期患者中表達(dá)顯著高于慢性期、恢復(fù)期及健康對照組(P0.05)。Th2細(xì)胞比例在慢性患者中最高,顯著高于急性期、恢復(fù)期與健康對照組,在急性期患者中表達(dá)比例高于恢復(fù)期與健康對照組(P0.05),在恢復(fù)期患者與健康對照組之間未見統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。Th2細(xì)胞分泌為主的細(xì)胞因子IL-4表達(dá)水平在慢性期及恢復(fù)期患者中表達(dá)顯著高于急性期與健康對照組(P0.05),慢性期與恢復(fù)期患者間表達(dá)無顯著差異(P0.05),急性期患者表達(dá)高于健康對照組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);細(xì)胞因子IL-5的表達(dá)在慢性期患者中高于急性期、恢復(fù)期患者及健康對照組(P0.05);細(xì)胞因子IL-13在慢性期患者中表達(dá)水平顯著高于急性期、恢復(fù)期患者及健康對照(P0.05)。Th17細(xì)胞比例在急性期與慢性期患者中表達(dá)均高于恢復(fù)期患者和健康對照(P0.05),急、慢性患者間表達(dá)未見顯著差異(P0.05)。Th17細(xì)胞分泌為主的細(xì)胞因子IL-17A的表達(dá)在急性期、慢性期及恢復(fù)期患者中表達(dá)無顯著差異(P0.05),在三組患者中表達(dá)均高于健康對照(P0.05);細(xì)胞因子IL-17F在慢性期患者中表達(dá)水平最高,顯著高于急性期、恢復(fù)期患者健康對照組(P0.05)。Treg細(xì)胞在急性期與慢性期患者中表達(dá)均高于恢復(fù)期患者和健康對照(P0.05),急、慢性患者間表達(dá)未見顯著差異(P0.05)。(4)通過攻毒4周后小鼠血清試管凝集試驗和小鼠脾臟細(xì)菌培養(yǎng)證實小鼠感染布魯菌模型建立成功,流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,感染布魯菌2周后小鼠外周血中PD-1開始出現(xiàn)增高,感染4周后PD-1表達(dá)最高,于第8周出現(xiàn)下調(diào),隨后逐漸下降;Th1細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ于感染2周即升高,IFN-γ在感染4周時表達(dá)達(dá)高峰,IL-2表達(dá)水平隨時間逐漸增高;Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13在感染初期升高不明顯,在第8周后開始明顯升高;Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A在感染4周后表達(dá)逐漸增高,IL-17F在感染2周左右開始輕度增高。Th9相關(guān)細(xì)胞因子IL-9在感染4周開始增高,第8周表達(dá)水平達(dá)高峰;Th22型細(xì)胞因子IL-22于感染1周后升高,并持續(xù)維持在較高水平。IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-17A的表達(dá)水平與感染時間正相關(guān)(P0.05),IL-5的表達(dá)水平與IL-13、IL-17A和IL-4的表達(dá)均呈正相關(guān)(P0.05),IL-17F與CD4+和CD8+T細(xì)胞表面的PD-1表達(dá)呈正相關(guān)(P0.05),CD4+與CD8+T細(xì)胞表面的PD-1表達(dá)正相關(guān)(P0.05)。布魯菌感染小鼠4周后可以觀察到肝臟組織出現(xiàn)水腫變性炎癥損傷,肝臟炎癥病變在8周時程度最重,隨著感染時間延長,肝臟炎癥損傷開始減輕。給予布魯氏桿菌感染小鼠PD-1抗體后,CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平下降(P0.05),PD-1抗體干預(yù)的小鼠在第4周時細(xì)胞因子IL-17和IL-9表達(dá)高于Brucella組(P0.05),IFN-γ表達(dá)水平低于Brucella組(P0.05)。第12周時Brucella+PD-1Ab組IL-13、IL-4、IFN-γ、IL-2和IL-9的表達(dá)水平低于Brucella組(P0.05),IL-17F和IL-22表達(dá)則顯著高于Brucella組(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示PD-1抗體處理組的感染小鼠肝臟炎癥損傷程度小。結(jié)論:(1)我國布魯菌病患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,可累及多系統(tǒng),成人與兒童患者中臨床表現(xiàn)存在部分差異,布魯菌患者首診時易出現(xiàn)誤診,本研究為臨床準(zhǔn)確及時診斷提供了一定的理論依據(jù)。(2)布魯菌病患者體內(nèi)存在明顯的免疫功能紊亂現(xiàn)象,CD4+和CD8+T細(xì)胞可能為影響布魯菌病進(jìn)展的免疫因素。(3)患者感染布魯菌后在急性期以Th1、Th17和Treg細(xì)胞免疫為主,慢性期則由Th2、Th17和Treg細(xì)胞免疫為主導(dǎo)。同時觀察到患者在臨床治愈后短時間內(nèi)免疫功能尚未完全恢復(fù),需要對恢復(fù)期患者長期隨訪。(4)布魯菌感染引起小鼠外周血中PD-1表達(dá)的增高,在感染初期主要以Th1和Th22細(xì)胞分泌為主的細(xì)胞因子增高,隨著病程進(jìn)展,Th2、Th9、Th17和Th22細(xì)胞為主的免疫應(yīng)答增強(qiáng);布魯菌感染后可引起肝臟發(fā)生炎癥損傷,急性感染階段肝臟炎癥損傷較慢性感染階段程度重。PD-1抗體可減輕感染小鼠肝臟損傷,PD-1抗體在布魯菌感染時可調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17和Th9細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),提示PD-1可能參與了布魯菌感染的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)。
【圖文】：

CD3+T細(xì)胞數(shù)據(jù)的漏斗圖

圖1-4 CD3+T細(xì)胞數(shù)據(jù)的 Egger圖Figure1-4 Egger diagram of CD3+T cell data文獻(xiàn)中，兩篇研究結(jié)果顯示布魯菌病患者組中CD3+T細(xì)獻(xiàn)研究結(jié)果示CD3+T細(xì)胞比例在患者組與健康對照組學(xué)異質(zhì)性較大（I2=85.6%，95% CI（72.4%；92.5%），模型進(jìn)行分析（見圖1-5）。結(jié)果顯示：布魯菌病患病組對照組的趨勢，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義[MD=1.1319），P=0.3631]。所以，尚不能認(rèn)為布魯菌病患病組照組。
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R516.7

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本文編號：2621872