【摘要】：煙曲霉是曲霉感染的最常見致病菌,煙曲霉生物膜的形成是其致病的重要毒力因素之一。巨噬細胞能夠有效識別并清除入侵的煙曲霉。本文主要探討了體外抗煙曲霉生物膜效應與機制及MicroRNA-146a對煙曲霉誘導THP-1巨噬樣細胞固有免疫反應的調(diào)控作用機制。第一章主要探討可耐受熱效應對煙曲霉生物膜抑制作用的相關(guān)機制。我們前期在體外構(gòu)建煙曲霉生物膜發(fā)現(xiàn)熱效應作用于煙曲霉生物膜生長過程時,菌絲的極性生長及生物膜的形成均受到抑制。菌絲的極性生長破壞程度與溫度呈正相關(guān),溫度越高,煙曲霉生物膜的三維結(jié)構(gòu)越松散,生物膜形成的量越少,活力也越差。為進一步探究熱效應對煙曲霉生物膜的極性生長的影響,我們利用乙醇脫氫酶啟動子-融合PCR技術(shù)構(gòu)建CaM-RFP煙曲霉菌株,在熒光顯微鏡下觀察不同溫度作用于煙曲霉時,CaM在菌絲極性生長過程中的動態(tài)分布情況,在正常溫度培養(yǎng)時,發(fā)現(xiàn)紅色熒光標記的CaM主要集中在孢子萌芽的一端。隨著菌絲的逐漸延長,CaM一直定位在菌絲生長的頂端。當菌絲頂端之外出現(xiàn)紅色熒光的點時,提示在該點會有新的分枝出現(xiàn)。在熱效應作用下芽體頂端CaM彌散分布于菌絲頂端及其下方,推測菌絲出現(xiàn)過多的分枝及不能很好的維持菌絲的極性生長可能與CaM分布相關(guān)。我們利用q-RT-PCR方法檢測了鈣通道蛋白CchA、MidA基因表達水平,發(fā)現(xiàn)熱效應下煙曲霉生物膜中CchA、MidA基因表達上調(diào)。實驗結(jié)果揭示了鈣信號系統(tǒng)參與熱效應對煙曲霉生物膜的抑制作用。第二章主要探討了 ALA-PDT對煙曲霉生物膜的抑制效應。首先利用XTT法測定ALA溫育的時間和ALA用藥的濃度,接著進一步探討了不同光照劑量的ALA-PDT對體外煙曲霉生物膜的抑制作用。光劑量為25 J/cm2時,煙曲霉生物膜的結(jié)構(gòu)基本上沒有變化。使用50J/cm2光劑量照射時,生物膜的結(jié)構(gòu)開始疏松,菌絲縮短。當光劑量調(diào)整為1OOJ/Cm2照射時,生物膜的結(jié)構(gòu)更加疏松,菌絲逐漸斷裂。光照組、光敏劑組生物膜結(jié)構(gòu)基本不變。結(jié)果表明ALA-PDT對體外煙曲霉生物膜具有一定的抑制作用。本研究的第三章主要探討巨噬細胞針對煙曲霉的免疫反應所發(fā)揮的作用,以THP-1巨噬樣細胞為研究對象,給予滅活的煙曲霉孢子體外誘導,通過q-PCR、ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)促炎癥因子TNF-α和IL-6表達水平的增加,并呈現(xiàn)時間依賴效應;通過western blotting、共聚焦顯微鏡證明p38 MAPK、NF-κB等信號分子被激活,且通過流式細胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)胞膜TLR2、TLR4及Dectin-1受體表達下調(diào),證明其參與了對煙曲霉的識別和內(nèi)吞。接下來我們初步探討了MiR-146a對煙曲霉感染固有免疫反應的調(diào)控作用。首先通過q-RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)煙曲霉可以誘導THP-1巨噬樣細胞miR-146a mRNA表達上調(diào),當分別用受體及信號分子抑制劑阻斷后發(fā)現(xiàn)THP-1巨噬樣細胞miR-146a mRNA的表達均有不同程度的降低,表明miR-146a的表達與TLR2、TLR4和Dectin-1介導的信號通路有關(guān)。為了明確miR-146a在煙曲霉感染中具體的調(diào)控作用,通過轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物及miR-146a抑制劑改變THP-1巨噬樣細胞miR-146a的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-146a后可抑制THP-1巨噬樣細胞對于煙曲霉誘導的炎癥因子TNF-α及IL-6 rnRNA表達和蛋白分泌水平;而轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑后,則可促進TNF-α及IL-6 rnRNA的表達和蛋白分泌水平,說明miR-146a可以負向調(diào)節(jié)IL-6和TNF-α的表達。通過免疫熒光法也觀察到,轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后NF-κκB-p65在煙曲霉刺激后轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)顯著減少,而轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑后NF-κB-p65入核則明顯增加;表明煙曲霉感染中miR-146a可能對NF-κB途徑發(fā)揮了負向的調(diào)控作用。采用q-RT-PCR和westemblot分別檢測miR-146a的兩個靶基因IRAK1和TRAF6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白翻譯水平表達情況。上調(diào)miR-146a表達后,IRAK1和TRAF6 mRNA表達及蛋白翻譯水平均明顯抑制,而下調(diào)miR-146a表達水平后,IRAK1和TRAF6 mRNA及蛋白表達水平則明顯增高。本章結(jié)論:煙曲霉刺激THP-1巨噬樣細胞活化的TLR2、TLR4和Dectin-1受體及其下游的信號通路引起炎癥因子TNF-α和IL-6的表達,miR-146a在煙曲霉誘導THP-1巨噬樣細胞產(chǎn)生的炎癥反應中發(fā)揮了負向調(diào)控作用。
【圖文】：

圖２邋ＣａＭ－ＲＦＰ煙曲霉Ａ１１６０菌株的構(gòu)建原理不怠圖逡逑５．煙曲霉在生長過程中ＣａＭ的動態(tài)定位分布：逡逑（１）用ｌｍｌ注射器針頭將ＣａＭ－ＲＦＰ煙曲霉Ａ１１６０孢子點接種在單層Ｙ養(yǎng)基的載玻片上，放入不同的溫度下培養(yǎng)。逡逑Ｃ２）培養(yǎng)１６ｈ后在不同的時間點取出載玻片，孢子經(jīng)過一段時間培培養(yǎng)基上形成微小的單菌落。逡逑（３）直接在熒光顯微鏡下觀察長在邊緣的單根菌絲中ＣａＭ紅色熒光變６．熒光定量ＰＣＲ方法檢測相關(guān)鈣調(diào)蛋白ＣｃｈＡ、ＭｉｄＡ的基因表達逡逑（１）煙曲霉生物膜制備：生物膜制備分為３組，對照組、不同的熱效４１邋°Ｃ）進行培養(yǎng)。逡逑（２）收集生物膜細胞，加入適量液氮，研磨至粉末狀。逡逑（３）細胞總ＲＮＡ的提取按照ＴＲｉｚｏｌ操作說明書具體步驟進行，測出，一ＲＮＡｃＤＮＡ。逡逑

圖４不同熱效應下煙曲霉細胞生長變化逡逑２．熱效應對煙曲霉生物膜活力的影響逡逑利用酶標儀４９０ｎｍ波長處的吸光值（ＯＤ邋４９０）檢測生物膜細胞的生長活結(jié)果如圖５，可以發(fā)現(xiàn)，從４ｈ開始，與３７°Ｃ相比，３９°Ｃ，４１°Ｃ組ＯＤ值高，從１０ｈ－１６ｈ，邋３９°Ｃ，，４１°Ｃ組ＯＤ值增加的更為明顯，從圖中可以看出，與３９°Ｃ組的ＯＤ值也有明顯的差別。提示熱效應作用下細胞增生更為１６ｈ－２４ｈ，３９°Ｃ，４１°Ｃ組ＯＤ值上升不那么明顯，反而３７°Ｃ正常溫度組的速上升，在２４ｈ時達到峰值，之后到７２ｈＯＤ值趨于穩(wěn)定。結(jié)果顯示在生的后期，與３７°Ｃ正常溫度組相比，熱效應作用下煙曲霉生物膜的活力則生物膜形成的量也明顯減少。逡逑？邋１．２－１逡逑｜邐ｆ一￣？一－？邐－＾３７逡逑？邋１０－邐／邐－Ｂ－邋３９逡逑ｄ0．８－邐／／ａ邐°邐°邐４１逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R519

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本文編號：2620823