【摘要】：結核病是一種由結核分支桿菌引起的人畜共患傳染病,能夠引起大范圍感染、畸形甚至死亡。自2015年起,結核病超越艾滋病毒感染成為全球感染死亡的主要原因,每年均導致上百萬人死亡和巨大的經(jīng)濟損失。由于缺乏有效的治療方案,以及各種耐藥菌種的出現(xiàn),結核病的預防和治療仍是當今世界面臨的主要難題之一。巨噬細胞是對抗入侵病菌的第一道防線,它能夠吞噬病菌,啟動炎癥反應,指導適應性免疫細胞,最終清除病菌、消除炎癥、恢復體內平衡。然而,結核分支桿菌作為一個強大的胞內寄生菌,在與宿主細胞的長期對抗中,進化出各種策略來躲避宿主的防御機制,并在巨噬細胞中建立合適的條件進行生存和擴散,將巨噬細胞作為其自然棲息地和在宿主中傳播的工具。因此,深入了解結核分支桿菌在巨噬細胞中引起的免疫反應以及其逃避機制,對于開發(fā)有效的疫苗和針對持續(xù)性細胞內感染的靶向免疫治療具有重要意義。越來越多的證據(jù)表明,促炎性細胞因子IL-32在宿主對結核分支桿菌等病原體的防御中發(fā)揮著重要作用。由于選擇性剪接,IL-32存在多種剪接異構體,可發(fā)揮不同的生物學功能。其中,IL-32γ可通過誘導細胞凋亡,激活維生素D抗菌通路等機制抑制細胞中結核分支桿菌的增殖。然而其他剪接異構體對結核分支桿菌感染的影響還鮮有研究。因此,本研究深入探討了結核分支桿菌感染時巨噬細胞中IL-32對細菌增殖的影響,并描述了IL-32ε誘發(fā)抗菌效應和細胞凋亡的潛在機制。主要研究內容及結果如下:1.本研究對結核分支桿菌感染前后巨噬細胞中IL-32不同剪接異構體表達量變化進行了檢測。結果顯示,結核分支桿菌感染后,巨噬細胞中IL-32多種剪接異構體均有表達,然而表達水平差異顯著,其中攻菌后IL-32γ表達量最高,IL-32ε在攻菌前后表達量變化最大。2.由于結核分支桿菌能夠誘導IL-32多種剪接異構體不同程度的表達,因此本研究進一步對這些剪接異構體的抗結核作用進行了探索。結果顯示,IL-32不同剪接異構體對巨噬細胞中結核分支桿菌增殖的影響不同。其中,IL-32γ和IL-32ε實驗全程均顯示出顯著的抗菌效果,IL-32β和IL-32δ于檢測的后半段對細菌的增殖也有不同程度的抑制,而IL-32α和IL-32ζ的抗菌效果并不顯著。3.鑒于細胞凋亡是IL-32抵抗結核分支桿菌感染的有效途徑,因此本研究進一步探究了IL-32不同剪接異構體對細胞凋亡的影響。結果顯示,IL-32不同剪接異構體對巨噬細胞凋亡的誘導能力存在差異。IL-32β、IL-32γ和IL-32ε對細胞凋亡率的上調極為顯著,IL-32δ僅微弱提高細胞凋亡率,而IL-32α和IL-32ζ對細胞凋亡沒有影響。進一步研究發(fā)現(xiàn),區(qū)別于IL-32β和IL-32γ對Caspase-3的高活化率,IL-32ε過表達細胞中并未檢測到Caspase-3的激活。并且凋亡相關基因定量結果顯示,在IL-32ε過表達細胞中僅有Caspase-6和c-Myc表達上調。因此,本研究認為IL-32ε通過不依賴于Caspase-3的機制誘導細胞凋亡。4.為了進一步探究IL-32ε介導細胞凋亡的信號通路,本研究著重對IL-32ε與Nmi和β-catenin之間的相互聯(lián)系進行了分析。結果顯示,IL-32ε能夠誘導巨噬細胞中Nmi的表達。并且,利用siRNA敲降Nmi,能夠廢除IL-32ε介導的抗菌效應和細胞凋亡。此外,IL-32ε過表達細胞中β-catenin蛋白水平顯著降低,在IL-32ε過表達細胞中補充β-catenin也能夠抑制IL-32ε介導的細胞凋亡。因此,本研究表明,IL-32ε通過上調Nmi表達,降低細胞內β-catenin蛋白水平,引起細胞凋亡。5.為了探究IL-32ε誘導Nmi表達上調的機制,本研究通過雙熒光素酶報告分析逐步篩選出Nmi啟動子中應答IL-32ε誘導的核心區(qū)域,并深入研究找到了調控IL-32ε誘導Nmi轉錄的關鍵轉錄因子Pax6和CP2。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),p38 MAPK在這一過程中起到橋梁作用,即IL-32ε通過激活p38 MAPK信號通路上調Pax6和CP2的轉錄活性,進而上調Nmi表達水平,明確了IL-32ε誘導Nmi表達的機制。綜上所述,在巨噬細胞中,結核分支桿菌能夠誘導多種IL-32剪接異構體的表達,且不同剪接異構體的抗菌能力存在差異。其中,結核分支桿菌誘導IL-32ε表達,導致p38 MAPK信號通路激活以及轉錄因子Pax6和CP2活化,促進了細胞中Nmi的表達。隨后,Nmi的上調使細胞中β-catenin蛋白水平下降,最終導致了依賴于Caspase-6和c-Myc的細胞凋亡。這一機制在巨噬細胞抵抗結核分支桿菌感染的過程中發(fā)揮著重要作用,可能為結核病的預防及治療提供了新的靶標。
【圖文】：

3圖 1-1 結核分支桿菌在體內的增殖過程(Russell et al., 2010)。Fig.1-1 The proliferation of Mycobacterium tuberculosis in vivo.1.1.4 結核病的治療與診斷活動性結核病患者通常會出現(xiàn)肺部或全身癥狀，包括咳嗽、胸痛、疲勞和無意識的體重減輕。然而結核分支桿菌能夠長期潛伏于有機體，大約 90%的感染以潛伏狀態(tài)存在(Zumla, 2013)。因此，臨床診斷的進展對控制疾病的傳播至關重要。潛伏感染通常通過純化蛋白衍生物試驗或 IFN 釋放分析進行檢測(Al-Orainey, 2009)。而在活動性感染中，建議采用胸片以及三份痰標本的耐酸染色和培養(yǎng)進行分析診斷(Dheda et al., 2016)。此外，疾病控制與預防中心建議對所有考慮診斷為結核分支桿菌感染的個體進行呼吸道標本的核酸擴增。并且，如果臨床對感染的懷疑度很高，甚至在陽性檢測結果出來

第一章 文獻綜述et al., 2012)。這個過程稱為胞葬，對炎癥的解決至關重要(Weiss and Schaible, 2015)。通過胞葬吞噬的含有結核分支桿菌的吞噬體隨后與溶酶體融合，導致了細菌更大范圍的降解(Martin et al., 2012)。細胞凋亡抗結核的機制是，將結核分支桿菌隔離在凋亡細胞中，阻止了細菌不可控的傳播，并抑制其毒力因子干擾吞噬體成熟。巨噬細胞作為機體抗菌免疫應答的中心，在抵抗結核分支桿菌感染和控制結核病進程中發(fā)揮著不可或缺的作用。事實上，，在與宿主細胞長期的對抗中，結核分支桿菌進化出一系列的策略來抵消宿主免疫應答帶來的抗菌效果（圖 1-2），從而成功地在巨噬細胞中建立長期生存的空間(Jayachandran et al., 2013)。這個對抗是長期存在的，并且由于耐藥菌株尤其是多重耐藥（MDR）和廣譜耐藥（XDR）菌株的出現(xiàn)而變得更為復雜(Guirado et al., 2013; Warner and Mizrahi, 2013)。因此，明確了解特定病原體引起的宿主免疫反應以及病原體的逃避機制，對于開發(fā)有效的疫苗和針對持續(xù)性細胞內感染的靶向免疫治療具有重要意義。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R52

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本文編號：2612101