本文關(guān)鍵詞：恒河猴Tetherin基因cSNP及HIV-1適應(yīng)性拮抗恒河猴Tetherin抗病毒作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：自然界中,病毒與宿主間存在協(xié)同進化的現(xiàn)象。一方面,宿主不斷進化出防御機制來抑制病毒入侵、復(fù)制等,另一方面,病毒針對宿主的防御機制也進化出獨特的機能來規(guī)避宿主對它的抑制。協(xié)同進化不僅促進了兩個相互作用物種之間的適應(yīng)性,增加了生物的多樣性,同時也對病毒跨物種傳播帶來了很大阻礙。在人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的研究中發(fā)現(xiàn),宿主細胞天然存在先天免疫因子,對病毒的侵入、復(fù)制和出芽存在限制作用。這些因子被稱為“宿主限制因子”,參與先天性免疫反應(yīng),干擾病毒生命周期的不同階段,達到對病毒的限制作用。目前已發(fā)現(xiàn)的限制因子有：APOBEC3G(apolipoprotein B mRNAediting enzyme 3G)、Trim5a (tripartite motif protein 5a)、Tetherin(也被稱做CD317或HM1.24)、SAMHD1 (sterile a motif domain and HD domain-containing protein 1) [4,5]。這些限制因子可有效地限制逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染,是宿主抵抗病毒感染的一個重要防御屏障。Tetherin是一種具有特殊拓撲結(jié)構(gòu)的脂筏相關(guān)跨膜蛋白,它可通過連接病毒和宿主細胞膜,將新出芽的病毒束縛在細胞膜表面,從而限制病毒釋放。在恒河猴免疫缺陷病毒(SIV)／恒河猴實驗動物模型的研究中,人們同樣發(fā)現(xiàn)了恒河猴細胞內(nèi)也存在Tetherin蛋白來抑制SIV在恒河猴體內(nèi)的擴散。而且恒河猴的Tetherin基因具有一定多態(tài)性,但是對于恒河猴Tetherin基因多態(tài)性及其多態(tài)性對自身蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響并沒有明確報道。另一方面,Tetherin作為一種天然抗病毒蛋白,在不同的物種中,它的蛋白結(jié)構(gòu)也有所不同,具有物種特異性[2]。如果能使HIV跨過恒河猴Tetherin蛋白的限制作用,這可以成為對AIDS動物模型優(yōu)化的重要一步。方法：本研究通過基因測序、序列比對、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測等技術(shù),探尋恒河猴tetherin基因位置上可能影響其蛋白功能的cSNP位點,再把不同基因型的tetherin插入到真核表達載體pcDNA3.1(.)中,構(gòu)建不同基因型的tetherin表達載體。用不同基因型的tetherin表達載體與SIVmac239共轉(zhuǎn)染293T細胞,檢測轉(zhuǎn)染后SIV的病毒載量,以及流式檢測Tetherin基因在細胞表面的表達情況,最后對恒河猴進行基因型的分類,比較不同基因型SIV感染恒河猴之間的病毒復(fù)制情況。另一方面,構(gòu)建表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL細胞系,通過HIV-1NL4-3在表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL與不表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL的混合細胞中培養(yǎng),在體外模擬自然進化,最終使得HIV-1NL4-3能夠產(chǎn)生適應(yīng)性毒株,感染表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL,實現(xiàn)HIV-1NL4-3對恒河猴Tetherin限制作用的跨越。結(jié)果：序列比對發(fā)現(xiàn)8個非同義突變位點;用Psipred軟件預(yù)測分析,發(fā)現(xiàn)其中G41A、T128C、C129和A333C這四個cSNP位點會使Tetherin蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在各基因型恒河猴tetherin表達載體與SIVmac239共轉(zhuǎn)染293T的試驗中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染不同tetherin表達載體的293T細胞表達SIV病毒的載量之間并無統(tǒng)計學(xué)差異。但是不同基因型恒河猴的tetherin基因轉(zhuǎn)染細胞后Tetherin蛋白表達有所不同,GLQ和GPH型的恒河猴Tetherin蛋白表達要顯著高于DLQ和DPH型。在對不同基因型恒河猴的SIVmac239后病毒復(fù)制峰值和病毒復(fù)制控制值的比較中,發(fā)現(xiàn)DLQ基因型恒河猴病毒復(fù)制水平要高于GLQ型恒河猴(p0.05),其他基因型恒河猴的感染值之間沒有顯著差異。成功構(gòu)建表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL后,通過HIVNL4-3分別在表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL中和不表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),比較兩種細胞感染之間的病毒蛋白P24濃度以及活力,發(fā)現(xiàn)不同組別之間病毒P24濃度沒有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論：在中國恒河猴的tetherin基因中,我們發(fā)現(xiàn)了9個cSNP位點,其中有四個cSNP位點(G41A、T128C、C129和A333C)可影響Tetherin蛋白的二級結(jié)構(gòu)。經(jīng)過體外細胞實驗和恒河猴體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),恒河猴Tetherin基因的cSNP并沒有影響其抗病毒作用,但卻可以影響SIV對其拮抗作用。在HIVNL4-3對表達恒河猴Tetherin的TZM-BL的適應(yīng)性培養(yǎng)中,我們并沒有發(fā)現(xiàn)恒河猴Tetherin蛋白對HIVNL4-3的抑制作用,但這并不能說明恒河猴Tetherin蛋白對HIVNL4-3沒有抑制作用,雖然Tetherin蛋白可以把病毒束縛在宿主細胞表面,但我們不能排除病毒通過細胞與細胞之間的接觸反而使得病毒更容易發(fā)生擴散。
【關(guān)鍵詞】：恒河猴 Tetherin cSNP SIV HIV
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.91
【目錄】：

• 英文縮寫詞4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-12
• 第一部分 恒河猴猴tetherin基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性及其對蛋白功能的影響12-38
• 第一節(jié) 引言12-13
• 第二節(jié) 實驗材料13-17
• 第三節(jié) 實驗方法17-30
• 第四節(jié) 實驗結(jié)果30-36
• 第五節(jié) 討論36-38
• 第二部分 HIV-1適應(yīng)性拮抗恒河猴Tetherin抗病毒作用的研究38-56
• 第一節(jié) 引言38-39
• 第二節(jié) 實驗材料39-43
• 第三節(jié) 實驗方法43-52
• 第四節(jié) 實驗結(jié)果52-55
• 第五節(jié) 討論55-56
• 參考文獻56-59
• 綜述59-67
• 參考文獻64-67
• 致謝67-68
• 個人基本情況68-69
• 碩士期間論文發(fā)表情況69-70

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本文編號：261080