本文關(guān)鍵詞：等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增方法檢測扎伊爾型埃博拉病毒研究及同向平行DNA擴(kuò)增探討，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：病毒性傳染病一直是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。且大部分的病毒性傳染病尚無有效的疫苗和治療藥物。因此建立準(zhǔn)確、快速、可靠的診斷方法已成為預(yù)防和控制傳染性疾病的重要措施。埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD)也被稱作埃博拉出血熱(Ebola hemorrhagic fever,EHF),該疾病是由埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)引起的急性出血性傳染病,2014年西非暴發(fā)埃博拉疫情,此次疫情是自1976年埃博拉病毒被發(fā)現(xiàn)以來,規(guī)模最大、波及范圍最廣的,受到全球關(guān)注。當(dāng)前,核酸檢測方法已成為一種非常重要的檢測手段,核酸檢測依據(jù)是否具有溫度循環(huán)依賴性可分為變溫?cái)U(kuò)增和恒溫?cái)U(kuò)增。變溫?cái)U(kuò)增以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為代表,但該類方法耗時(shí)較長,且需要精密儀器。相比而言,等溫核酸擴(kuò)增方法如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法(Loop mediated isothermal amplification,LAMP)、等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增方法(Isothermal multiple-self-matching-initiated amplification, MSA)是在恒定溫度下進(jìn)行反應(yīng),其具有快速、靈敏、高效、特異性高的特點(diǎn),對(duì)設(shè)備要求低,非常適合現(xiàn)場和基層工作需要。首先本文分別建立了針對(duì)扎伊爾型埃博拉病毒(Zaire Ebola virus, ZEBOV)核蛋白基因(nuclear protein,NP)以及糖蛋白基因(Glycoprotein, GP)的等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增方法-RT-IMSA (NP,GP),并且針對(duì)NP基因建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法--RT-qPCR(NP)。根據(jù)Gen Bank中公布的埃博拉病毒的NP基因、GP基因序列,經(jīng)過序列比對(duì)選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)引物并且在恒定溫度63℃的條件下進(jìn)行擴(kuò)增。通過顏色判定法和實(shí)時(shí)熒光法進(jìn)行結(jié)果判定。對(duì)登革病毒和腦炎病毒及健康人血漿進(jìn)行了特異性驗(yàn)證,無交叉反應(yīng)；且對(duì)梯度稀釋的體外轉(zhuǎn)錄RNA、以及含有ZEBOV NP基因、GP基因擴(kuò)增區(qū)域的病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)進(jìn)行靈敏度分析,并且與李阿茜等人建立的檢測埃博拉病毒GP基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法--RT-qPCR(GP)進(jìn)行平行比較。結(jié)果顯示,無論是體外轉(zhuǎn)錄RNA還是病毒樣顆粒,RT-IMSA(NP)與自己建立的RT-qPCR(NP)靈敏度相當(dāng),為103拷貝／反應(yīng),RT-IMSA(GP)與RT-qPCR(GP)靈敏度相當(dāng),為102拷貝／反應(yīng)。同時(shí)在塞拉利昂完成了RT-IMSA(NP)的埃博拉疑似病例血液樣本的檢測,并與中國疾病預(yù)防控制中心獲批的檢測埃博拉病毒的熒光定量PCR試劑盒比較。臨床樣本結(jié)果顯示：與已獲批的熒光定量PCR試劑盒比較,RT-MSA(NP)的靈敏度和特異性分別91.4%和100%。因此,上述等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增方法有望應(yīng)用于埃博拉病毒感染的快速篩選,具有在偏遠(yuǎn)地區(qū)應(yīng)用的潛力。其次,本研究探討了DNA在同向平行互補(bǔ)的情況下是否可以實(shí)現(xiàn)延伸與擴(kuò)增這一問題。通過重復(fù)相關(guān)文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)和設(shè)計(jì)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn),結(jié)果證明DNA在同向平行互補(bǔ)的情況下,無論是進(jìn)行聚合酶螺旋式反應(yīng)(polymerase Spiral Reaction, PSR),或是進(jìn)行平行互補(bǔ)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(parallel direction polymerase chain reaction, PD-PCR)均不能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。綜上所述,本研究成功建立了針對(duì)扎伊爾型埃博拉病毒NP基因和GP基因的等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增方法—RT-MSA(NP)和RT-MSA(GP),為埃博拉病毒感染快速診斷提供了技術(shù)支持,為應(yīng)對(duì)國內(nèi)可能發(fā)生的疫情提供了技術(shù)儲(chǔ)備。此外,對(duì)DNA在同向平行互補(bǔ)情況下是否可以實(shí)現(xiàn)延伸與擴(kuò)增這一問題進(jìn)行了初步探討。
【關(guān)鍵詞】：等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增 埃博拉病毒 平行互補(bǔ)雙鏈DNA 同向平行DNA擴(kuò)增
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.8
【目錄】：

• 中英文縮寫一覽表5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一部分 等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增方法檢測扎伊爾型埃博拉病毒10-43
• 1 研究背景10-17
• 2 研究意義17-18
• Part1 RT-IMSA(NP)方法檢測扎伊爾型埃博拉病毒18-28
• 1 研究內(nèi)容18
• 2 技術(shù)路線18-19
• 3 實(shí)驗(yàn)材料19-25
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-28
• Part2 RT-IMSA(GP)方法檢測扎伊爾型埃博拉病毒28-43
• 1 研究目的及內(nèi)容28
• 2 實(shí)驗(yàn)材料28
• 3 實(shí)驗(yàn)方法28-34
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-40
• 5 討論40-42
• 6 小結(jié)42-43
• 第二部分 同向平行DNA擴(kuò)增探討43-58
• 1 研究背景43-46
• 2 研究意義46
• 3 研究內(nèi)容46-47
• 4 實(shí)驗(yàn)材料47-48
• 5 實(shí)驗(yàn)方法48-51
• 6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-56
• 7 討論56-57
• 8 小結(jié)57-58
• 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士研究生期間發(fā)表的文章68-69
• 個(gè)人簡歷69

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本文編號(hào)：260313