本文關(guān)鍵詞：布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)診斷方法評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：分析近10余年我國(guó)人間布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的使用現(xiàn)狀,并對(duì)其敏感度和特異度進(jìn)行評(píng)價(jià)；對(duì)三種原理不同的核酸提取方法提取核酸的效率及產(chǎn)物質(zhì)量進(jìn)行比較；建立布氏菌熒光定量PCR及布氏菌含量的計(jì)算方法,探索應(yīng)用于布魯氏菌病診斷的可行性；為《布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》的修訂提供技術(shù)支持。方法：按“布魯氏菌�。疾　焙汀皩�(shí)驗(yàn)室檢查／診斷方法”關(guān)鍵詞組合,在萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)、中國(guó)知網(wǎng)、中文期刊數(shù)據(jù)庫(kù)(維普)等中文數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索2004-2014年間有關(guān)布病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的文獻(xiàn)。統(tǒng)計(jì)各省份各檢測(cè)方法的檢測(cè)樣本量和各檢測(cè)方法的靈敏度、特異度及符合率。分別采用離心柱法(以TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒為代表)磁珠法(以Taco全DNA萃取試劑盒為代表)及水煮法提取濃度分別為1011、1010.5、1010、109.5、109 CFU/ml的布氏菌1 6M菌液,分別以50 μl、100 μl、200 μl(水煮法無洗脫步驟,不區(qū)分)的洗脫體積收集產(chǎn)物；用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)測(cè)量所提取核酸的濃度及純度等指標(biāo),并檢測(cè)各方法提取的核酸能否進(jìn)行PCR及熒光定量PC。用平板計(jì)數(shù)確定布氏菌濃度,用此菌液建立PCR及熒光定量PCR的檢測(cè)方法,及通過熒光定量PCR推算臨床標(biāo)本布氏菌濃度的參考系。并比較生理鹽水菌液與血清模擬樣本對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的影響,比較不同目的基因引物進(jìn)行普通PCR的檢測(cè)下限差異。結(jié)果：1.篩選得到檢查樣本數(shù)量及方法相關(guān)文獻(xiàn)共157篇,其中實(shí)驗(yàn)室檢查方法準(zhǔn)確性相關(guān)文獻(xiàn)共22篇。由24個(gè)省份報(bào)告,實(shí)際樣本檢測(cè)時(shí)間為1954-2012年,共使用14種方法檢查了716280份樣本。2.檢測(cè)方法中,檢測(cè)樣本量由大到小為試管凝集試驗(yàn)(SAT,256050份),虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT,224699份),皮膚過敏試驗(yàn)(184787份),平板凝集試驗(yàn)(PAT,33018份)等。3.24個(gè)省使用SAT,20個(gè)省使用RBT,10個(gè)省使用皮膚過敏試驗(yàn),7個(gè)省分離布氏菌；檢測(cè)樣本量由大到小為河南(114031份)、內(nèi)蒙古(104287份)、浙江(93484份)；使用的檢測(cè)方法由多到少為浙江(9種)、內(nèi)蒙古(7種)、山東和黑龍江(5種)。4.各檢測(cè)方法與SAT的符合率最高的是膠體金,為99.77%(9811/9834)；其次為PAT,為97.73%(86/88)；雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(DAgS-ELISA),96.49%(110/114);RBT,94.55%(2 465/2 607)；人免疫球蛋白G酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(IgG ELISA),86.38%(2068/2394);IgM ELISA,76.23%(1 825/2394);補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT),69.17%(83/120)；皮膚過敏試驗(yàn),56.36%(31/55)。5.在獲得核酸的產(chǎn)量上,離心柱法和磁珠法都遠(yuǎn)低于水煮法,而離心柱法稍高于磁珠法。離心柱法和磁珠法在菌液濃度1011～1010.5CFU/ml可得到最高濃度的產(chǎn)物,水煮法所得產(chǎn)物濃度隨著菌液濃度的升高呈線性增加。離心柱法中,核酸濃度隨洗脫體積的增加而減少,但對(duì)總產(chǎn)量的影響不大,故洗脫體積在50 μ 1～200 μ 1范圍內(nèi)均可。磁珠法隨著洗脫體積的增加,核酸濃度下降得更快,即在50μ1時(shí),總產(chǎn)量最高,2001x1時(shí)總產(chǎn)量最低。6.在純度上,水煮法最高(A260/A280、A260/A230比值最接近核酸對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)范圍),離心柱法其次,磁珠法最低。7.三種方法重復(fù)性都很好,結(jié)果穩(wěn)定；且PCR和熒光定量PCR結(jié)果均為陽(yáng)性。8.以b csp31作為目的基因,在108,～103CFU/ml范圍內(nèi)可得到熒光定量PCR典型擴(kuò)增。Ct值在108～103CFU/ml范圍內(nèi)與菌液濃度的對(duì)數(shù)值呈線性,標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=-3.0574x+46.171,R2=0.9968。9.生理鹽水菌液與血清模擬樣本熒光定量PCR的檢測(cè)下限相同,為103CFU/ml,各濃度Ct值沒有顯著差異。用B4/B5對(duì)兩種樣本進(jìn)行普通PCR,檢測(cè)下限也相同,為106CFU/ml。10.用IS313/IS639、brucl/bruc5分別檢測(cè)菌液樣本。IS313/IS639檢測(cè)下限為105 CFU/ml,brucl/bruc5的檢測(cè)卜限為10CFU/ml。結(jié)論：1.SAT的應(yīng)用范圍最廣,此次研究所涉及的24個(gè)省份都采用了,且檢測(cè)樣本量也是最大。RBT的檢測(cè)樣本量及使用省份其次,且靈敏度特異度均達(dá)到94%以上。2.近十年,皮膚過敏試驗(yàn)和PAT的使用單位相對(duì)RBT較少,檢查樣本量也小,分別為184787份及33018份。3.CFT、抗人免疫球蛋白試驗(yàn)(Coomb's)操作繁瑣,使用范圍小,CFT僅一個(gè)省份出現(xiàn)了報(bào)道,Coomb's僅兩省報(bào)道,近十年檢查樣本量不足150份。4.膠體金操作簡(jiǎn)便,可現(xiàn)場(chǎng)使用。檢測(cè)樣本量不大,只有浙江省報(bào)道。5. IgG ELISA的靈敏度、特異度均高,IgM ELISA靈敏度一般,但是可以分別檢測(cè)IgG及IgM,對(duì)布病病程判斷有一定參考價(jià)值。檢測(cè)樣本量不大,集中在內(nèi)蒙古、山東、北京。6.相比實(shí)驗(yàn)室常用的離心柱核酸提取法,磁珠法操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,耗時(shí)短,所得核酸完整度高,可用于樣本量大且后接大片段核酸實(shí)驗(yàn)研究。7.水煮法的產(chǎn)物濃度和純度都較高,耗時(shí)及費(fèi)用低,重復(fù)性好,但核酸斷裂嚴(yán)重,適用于樣本量大,低成本,后接小片段PCR擴(kuò)增時(shí)的核酸提取。8.菌液濃度的對(duì)數(shù)值與熒光定量PCR的Ct值滿足關(guān)系式y(tǒng)=-3.0574x+46.171,可用于估計(jì)患者標(biāo)本中的布氏菌含量。9.熒光定量PCR可檢測(cè)布氏菌下限濃度為103CFU/ml,普通PCR檢測(cè)布氏菌下限濃度為106CFU/ml。10.普通PCR檢測(cè)IS313/IS639的檢測(cè)下限為105 CFU/ml,B4/B5檢測(cè)下限為106 CFU/ml, Brucl/Bruc5檢測(cè)下限為107 CFU/ml。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌病 診斷試驗(yàn) 系統(tǒng)評(píng)價(jià) 布魯氏菌 核酸提取 熒光定量PCR PCR
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R516.7
【目錄】：

• 縮略詞6-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-21
• 第一部分 2004-2014年人間布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法系統(tǒng)評(píng)價(jià)21-31
• 1. 材料與方法21-23
• 2. 結(jié)果與分析23-27
• 3. 討論27-30
• 4. 小結(jié)與建議30-31
• 第二部分 三種方法提取布魯氏菌核酸的對(duì)比研究31-43
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法32-36
• 3. 結(jié)果36-40
• 4. 討論40-41
• 5. 小結(jié)41-43
• 第三部分 布魯氏菌PCR及熒光定量PCR臨床標(biāo)本檢測(cè)43-54
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料43-44
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法44-47
• 3. 結(jié)果47-52
• 4. 討論52-53
• 5. 小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 附錄1：布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)送審稿58-74
• 附錄2：作者簡(jiǎn)介74-75
• 致謝75

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本文編號(hào)：259271