【摘要】：宿主防御新生隱球菌感染是由活化的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞共同作用完成的。肺泡巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)一般被認(rèn)為是新生隱球菌感染的一線天然屏障。宿主感染新生隱球菌后,這些DC和巨噬細(xì)胞吞食并破壞侵入的隱球菌,向T細(xì)胞提呈隱球菌抗原,并產(chǎn)生啟動和引導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的介質(zhì)(細(xì)胞因子和趨化因子)。研究證明,肺臟DC和肺泡巨噬細(xì)胞的耗竭導(dǎo)致了感染新生隱球菌的小鼠病情迅速惡化和死亡。因此,肺泡巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在抗新生隱球菌免疫反應(yīng)中起著重要的作用,并在新生隱球菌感染過程中連接先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。IL-17作為Th17型細(xì)胞主要代表之一,在細(xì)胞外的細(xì)菌和真菌感染的清除中起著重要的作用。增加IL-17的產(chǎn)生與減少隱球菌負(fù)荷有關(guān),表明IL-17在產(chǎn)生保護(hù)性抗隱球菌免疫應(yīng)答方面也有重要作用。CCL7,也稱單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3)由于其強大的趨化作用,在許多病理機制中都有涉及。然而,其被IL-17調(diào)制,卻很少受到關(guān)注。在本研究中,我們以小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞為研究對象,證明了在新生隱球菌感染巨噬細(xì)胞中IL-17可介導(dǎo)CCL7的誘發(fā)。并且,這種效應(yīng)是通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路介導(dǎo),導(dǎo)致CCL7表達(dá)增加。了解CCL7表達(dá)的調(diào)控可以為新生隱球菌感染免疫潛在治療靶點的發(fā)展提供見解。第一部分:隱球菌腦膜炎患者外周血單個核細(xì)胞中IL-17表達(dá)降低本部分將探討患者外周血單個核細(xì)胞中IL-17的表達(dá)情況。納入上海長海醫(yī)院和長征醫(yī)院2008年5月~2016年8月患者28例,并且收集同時期健康對照者30例。分別分離其外周血單個核細(xì)胞,采用實時定量PCR檢測其IL-17表達(dá)量。結(jié)果顯示,與健康對照組相比,患者外周血單個核細(xì)胞中IL-17mRNA表達(dá)水平明顯降低。實驗室培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞至對數(shù)生長期,用熱滅活新生隱球菌刺激RAW264.7細(xì)胞,分別在刺激后的0、4、8、12小時后收集細(xì)胞和上清,進(jìn)行RT-PCR和ELISA檢測IL-17在基因和蛋白層面的表達(dá)。結(jié)果表明,熱滅活新生隱球菌與巨噬細(xì)胞系共培養(yǎng)后,IL-17 mRNA和蛋白的表達(dá)均呈時間依賴性增高,在12小時達(dá)到最高。本部分結(jié)果提示,IL-17可能通過影響新生隱球菌免疫應(yīng)答而參與到發(fā)病機制中。第二部分:巨噬細(xì)胞抗隱球菌感染免疫過程中MAPK/CCL7表達(dá)升高本部分將探討MAPK代表蛋白/CCL7在巨噬細(xì)胞抗新生隱球菌感染免疫中的表達(dá)。實驗室培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,待呈對數(shù)增長后與熱滅活新生隱球菌共培養(yǎng)12小時后收集上清,同時設(shè)立對照組,采用實時熒光定量PCR及ELISA檢測CCL7在基因和蛋白層面的表達(dá)水平。并用western blotting檢測實驗組與對照組分別培養(yǎng)0、8、12小時后巨噬細(xì)胞中MAPK的代表蛋白的表達(dá)水平。再分別用MAPK的代表蛋白ERK、JNK、p38的抑制劑預(yù)處理,檢測熱滅活隱球菌誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞CCL7的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,熱滅活隱球菌誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞CCL7表達(dá)明顯升高(P0.05),并且巨噬細(xì)胞中MAPK代表蛋白ERK、JNK和p38的磷酸化均增加;ERK、JNK的抑制劑預(yù)處理細(xì)胞,導(dǎo)致新生隱球菌感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)CCL7降低,而p38的抑制劑處理巨噬細(xì)胞則沒有這種現(xiàn)象。本部分結(jié)果提示巨噬細(xì)胞感染新生隱球菌后可以通過MAPK中的ERK、JNK信號通路來增強CCL7的產(chǎn)生來增強免疫。第三部分:IL-17可通過MAPK信號通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中CCL7的表達(dá)上調(diào)本部分將探討IL-17對新生隱球菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CCL7產(chǎn)生的調(diào)控機制。實驗室培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞,待其呈對數(shù)增長趨勢時分別以不同濃度的rhIL-17(25,50以及100 ng/ml)預(yù)處理巨噬細(xì)胞,并與新生隱球菌以1:10的比例共同孵育12小時。同時設(shè)立對照組,對照組為未加入rhIL-17預(yù)處理但與新生隱球菌以1:10的比例共孵育的等體積巨噬細(xì)胞,也即加入rhIL-17的濃度為0 ng/ml。1.不同濃度rhIL-17(0,25,50以及100 ng/ml)預(yù)處理后,ELISA檢測巨噬細(xì)胞抗新生隱球菌免疫過程中CCL蛋白的表達(dá)水平;用100 ng/ml rhIL-17預(yù)處理后,并用western blotting分別檢測巨噬細(xì)胞與新生隱球菌共培養(yǎng)0、8、12小時后ERK、p38、JNK的表達(dá)水平。2.控制實驗因素,即在用rhIL-17刺激之前,分別用各自信號通路的特定抑制劑處理巨噬細(xì)胞,并與新生隱球菌以1:10的比例共同孵育12小時后,ELISA檢測評估CCL7的表達(dá);另一方面,在用rhIL-17刺激巨噬細(xì)胞之前,用CCL7阻斷抗體處理,并與新生隱球菌以1:10的比例共同孵育12小時后,western blotting檢測ERK、JNK的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1.巨噬細(xì)胞在不同濃度的IL-17(對照組0ng/ml,實驗組25、50和100ng/ml)中培養(yǎng)12h,CCL7的表達(dá)在基因和蛋白層面都隨著IL-17的濃度的升高而依次遞增,在100 ng/ml時最高;而western blotting結(jié)果示:用100 ng/ml rhIL-17預(yù)處理后,巨噬細(xì)胞與新生隱球菌共培養(yǎng)后ERK、p38、JNK的磷酸化水平升高。2.ERK的抑制劑MEK(U0126,10μm)、JNK的抑制劑JNK(SP600125,10μm)預(yù)處理細(xì)胞,導(dǎo)致IL-17介導(dǎo)CCL7表達(dá)較對照組明顯降低,p38的抑制劑p38(SB203580,10μM)卻未產(chǎn)生明顯影響。而在用rhIL-17刺激之前,用CCL7阻斷抗體處理,然后以100 ng/ml rhIL-17預(yù)處理巨噬細(xì)胞,并與新生隱球菌以1:10的比例共同孵育12小時后,western blotting檢測ERK、JNK的表達(dá)水平,結(jié)果示,ERK、JNK表達(dá)無明顯改變。本部分結(jié)果提示:IL-17可以通過上調(diào)MAPK信號通路表達(dá)調(diào)節(jié)新生隱球菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CCL7的產(chǎn)生。
【圖文】：

圖 1.1 患者及健康對照者外周血 PBMC 中 IL-17 表達(dá)情況（* 表示患者組與健康對照組比較，P<0.05）隱球菌菌株 H99 刺激小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW264.7 后 IL-17mRN活新生隱球菌 H99 與生長至對數(shù)期的巨噬細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)，8、12 小時后收集細(xì)胞提取 RNA，利用特異性 IL-17 引物對其進(jìn)表達(dá)。R-T PCR 結(jié)果表明，，熱滅活新生隱球菌與巨噬細(xì)胞共培達(dá)成時間依賴性增高，在 12 小時達(dá)到最高。但在孵育第 4 小統(tǒng)計學(xué)差異，8小時和12小時表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異，P分別為0.0

P<0.05）2.新生隱球菌菌株 H99 刺激小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW264.7 后 IL-17mRNA 的表達(dá)（圖1.2）。熱滅活新生隱球菌 H99 與生長至對數(shù)期的巨噬細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)，分別在共培養(yǎng)的 0、4、8、12 小時后收集細(xì)胞提取 RNA，利用特異性 IL-17 引物對其進(jìn)行 RT-PCR檢測 IL-17 表達(dá)。R-T PCR 結(jié)果表明，熱滅活新生隱球菌與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，IL-17的 mRNA 表達(dá)成時間依賴性增高，在 12 小時達(dá)到最高。但在孵育第 4 小時表達(dá)與 0小時相比無統(tǒng)計學(xué)差異，8小時和12小時表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異，P分別為0.018和0.003。圖 1.2 新生隱球菌菌株 H99 與 RAW264.7 共培養(yǎng)不同時長后 IL-17mRNA 表達(dá)(*表示與共培養(yǎng) 0 小時比較，P<0.05
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R519.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 宋宇;劉海珠;;腎病綜合征合并播散性新生隱球菌病1例[J];中國感染與化療雜志;2016年05期

2 楊蕤,胡福定,畢虹,金志賢;纖維支氣管鏡檢查致肺新生隱球菌感染擴散一例[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2004年09期

3 郭秀軍;瘳萬清;;新生隱球菌的莢膜多糖合成研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊);2003年03期

4 陳劍 ,李若瑜;新生隱球菌常用哪些檢測方法?[J];中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2002年06期

5 陽眉;從一例巴西HIV感染者分離出非典型的新生隱球菌[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;2002年06期

6 馬廉蘭;新生隱球菌形態(tài)學(xué)實驗方法的改進(jìn)[J];贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2000年03期

7 唐寧楓;用表達(dá)的序列標(biāo)記制備染色體特異性探針以分離新生隱球菌[J];國外醫(yī)學(xué)(皮膚性病學(xué)分冊);1998年03期

8 唐寧楓;新生隱球菌和肺泡巨噬細(xì)胞間的相互作用[J];國外醫(yī)學(xué)(皮膚性病學(xué)分冊);1998年05期

9 吳建華;新生隱球菌的分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀及其展望[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;1994年06期

10 吳梅;全身性新生隱球菌病[J];江蘇醫(yī)藥;1986年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 趙亮;陳玉如;王梅竹;金方;顧桉菁;牟麗麗;羅紅梅;康穎倩;;新生隱球菌格魯比變種微進(jìn)化表型變異菌株的研究[A];2012年中國菌物學(xué)會學(xué)術(shù)年會會議摘要[C];2012年

2 法振宗;方偉;顧菊林;廖萬清;;新生隱球菌嗜中樞性機制研究進(jìn)展[A];2014全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2014年

3 朱元杰;溫海;徐紅;黃欣;趙瑾;;新生隱球菌與角質(zhì)形成細(xì)胞的體外相互作用[A];2006中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

4 陳裕充;潘煒華;溫海;廖萬清;顧菊林;徐紅;陳江漢;;采用基因芯片測定巨噬細(xì)胞吞噬前后新生隱球菌mRNA表達(dá)差異[A];2006中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

5 席麗艷;魯長明;龍澤香代子;福島和貴;;20株新生隱球菌生物學(xué)特性分析[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

6 王琳淇;;新生隱球菌社會性、致病性與毒力進(jìn)化的分子關(guān)聯(lián)[A];中國菌物學(xué)會2015年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2015年

7 趙亮;唐秀文;康穎倩;羅紅梅;金方;王梅竹;陳玉如;;貴州貴陽及廣西柳州地區(qū)新生隱球菌臨床株微衛(wèi)星基因分型對比研究[A];2012年中國菌物學(xué)會學(xué)術(shù)年會會議摘要[C];2012年

8 李秀麗;廖萬清;;一種新的測定新生隱球菌活力的染色方法[A];2006中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

9 李秀麗;田媛;史玉玲;顧俊瑛;劉至昱;李曉建;高飛;;蒺藜中甾體皂苷對新生隱球菌生物膜形成的抑制作用[A];2012全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

10 李莉;章強強;王家俊;朱利平;翁心華;張永信;;臨床及環(huán)境新生隱球菌對立�？颠蚝头颠虻捏w外敏感性實驗[A];2005全國首屆深部真菌感染學(xué)術(shù)會議論文集[C];2005年

相關(guān)重要報紙文章 前5條

1 記者 王小龍;新生隱球菌自我保護(hù)機制揭開[N];科技日報;2009年

2 ;伊曲康唑與兩性霉素B抗新生隱球菌臨床分離株的實驗研究[N];中國醫(yī)藥報;2003年

3 艷紅;養(yǎng)鴿謹(jǐn)防腦膜炎[N];中國婦女報;2003年

4 艷紅;養(yǎng)鴿謹(jǐn)防腦膜炎[N];保健時報;2003年

5 本報記者 何佳頤;養(yǎng)鴿子當(dāng)心患上腦膜炎[N];健康時報;2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 孔慶濤;低氧對新生隱球菌轉(zhuǎn)錄組的影響和隱球菌漆酶的表達(dá)純化[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

2 陳裕充;巨噬細(xì)胞對新生隱球菌活力和基因表達(dá)的影響[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

3 趙志宇;新生隱球菌莢膜相關(guān)基因CAP10調(diào)控機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

4 徐赤宇;絲氨酸蛋白酶介導(dǎo)隱球酵母細(xì)胞穿越血腦屏障機制及其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

5 楊陽;新生隱球菌與小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用中差異表達(dá)蛋白質(zhì)的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

6 侯幼紅;藥物和化學(xué)試劑對致病酵母細(xì)胞表面疏水性和粘附性的影響[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1994年

7 王溪濤;新生隱球菌穿越血腦屏障腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞機制及其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

8 汪曉軍;蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選新生隱球菌侵襲血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)及其表達(dá)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

9 李秀麗;新生隱球菌生物膜的構(gòu)建、影響因素及耐藥性的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

10 潘煒華;新生隱球菌分子重組操作系統(tǒng)的建立及其莢膜相關(guān)基因的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2000年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 常安妮;自噬對新生隱球菌有性生殖和致病性的影響[D];西南大學(xué);2018年

2 韓連濤;新生隱球菌致病性相關(guān)基因FRT1的鑒定及其功能研究[D];西南大學(xué);2018年

3 楊靜文;IL-6/STAT3/TGF-β軸在單核細(xì)胞抗新生隱球菌中的作用機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

4 胡紅麗;IL-17通過MAPK信號通路誘導(dǎo)CCL7在巨噬細(xì)胞抗新生隱球菌感染免疫中的表達(dá)[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

5 李穎芳;TGF-β對小鼠新生隱球菌感染及巨噬細(xì)胞功能影響的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

6 陳雪雯;新生隱球菌通過S100A10影響MMP9侵襲血腦屏障的機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

7 邊富寧;新生隱球菌Real-time PCR檢測方法的建立及其臨床分離株基因分型與耐藥性研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2015年

8 范娟;新生隱球菌感染后AQP4表達(dá)與腦水腫關(guān)系的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2008年

9 張蕾;PPP1R26-AS1調(diào)控單核細(xì)胞抗新生隱球菌免疫應(yīng)答及其疾病機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

10 趙荻;AQP4表達(dá)下調(diào)對新生隱球菌感染所致腦水腫的影響[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2009年

本文編號：2599592