【摘要】：宿主防御新生隱球菌感染是由活化的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞共同作用完成的。肺泡巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)一般被認(rèn)為是新生隱球菌感染的一線天然屏障。宿主感染新生隱球菌后,這些DC和巨噬細(xì)胞吞食并破壞侵入的隱球菌,向T細(xì)胞提呈隱球菌抗原,并產(chǎn)生啟動(dòng)和引導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的介質(zhì)(細(xì)胞因子和趨化因子)。研究證明,肺臟DC和肺泡巨噬細(xì)胞的耗竭導(dǎo)致了感染新生隱球菌的小鼠病情迅速惡化和死亡。因此,肺泡巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在抗新生隱球菌免疫反應(yīng)中起著重要的作用,并在新生隱球菌感染過程中連接先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。IL-17作為Th17型細(xì)胞主要代表之一,在細(xì)胞外的細(xì)菌和真菌感染的清除中起著重要的作用。增加IL-17的產(chǎn)生與減少隱球菌負(fù)荷有關(guān),表明IL-17在產(chǎn)生保護(hù)性抗隱球菌免疫應(yīng)答方面也有重要作用。CCL7,也稱單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3)由于其強(qiáng)大的趨化作用,在許多病理機(jī)制中都有涉及。然而,其被IL-17調(diào)制,卻很少受到關(guān)注。在本研究中,我們以小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象,證明了在新生隱球菌感染巨噬細(xì)胞中IL-17可介導(dǎo)CCL7的誘發(fā)。并且,這種效應(yīng)是通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路介導(dǎo),導(dǎo)致CCL7表達(dá)增加。了解CCL7表達(dá)的調(diào)控可以為新生隱球菌感染免疫潛在治療靶點(diǎn)的發(fā)展提供見解。第一部分:隱球菌腦膜炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-17表達(dá)降低本部分將探討患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-17的表達(dá)情況。納入上海長(zhǎng)海醫(yī)院和長(zhǎng)征醫(yī)院2008年5月~2016年8月患者28例,并且收集同時(shí)期健康對(duì)照者30例。分別分離其外周血單個(gè)核細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其IL-17表達(dá)量。結(jié)果顯示,與健康對(duì)照組相比,患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-17mRNA表達(dá)水平明顯降低。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用熱滅活新生隱球菌刺激RAW264.7細(xì)胞,分別在刺激后的0、4、8、12小時(shí)后收集細(xì)胞和上清,進(jìn)行RT-PCR和ELISA檢測(cè)IL-17在基因和蛋白層面的表達(dá)。結(jié)果表明,熱滅活新生隱球菌與巨噬細(xì)胞系共培養(yǎng)后,IL-17 mRNA和蛋白的表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增高,在12小時(shí)達(dá)到最高。本部分結(jié)果提示,IL-17可能通過影響新生隱球菌免疫應(yīng)答而參與到發(fā)病機(jī)制中。第二部分:巨噬細(xì)胞抗隱球菌感染免疫過程中MAPK/CCL7表達(dá)升高本部分將探討MAPK代表蛋白/CCL7在巨噬細(xì)胞抗新生隱球菌感染免疫中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,待呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)后與熱滅活新生隱球菌共培養(yǎng)12小時(shí)后收集上清,同時(shí)設(shè)立對(duì)照組,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及ELISA檢測(cè)CCL7在基因和蛋白層面的表達(dá)水平。并用western blotting檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別培養(yǎng)0、8、12小時(shí)后巨噬細(xì)胞中MAPK的代表蛋白的表達(dá)水平。再分別用MAPK的代表蛋白ERK、JNK、p38的抑制劑預(yù)處理,檢測(cè)熱滅活隱球菌誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞CCL7的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,熱滅活隱球菌誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞CCL7表達(dá)明顯升高(P0.05),并且巨噬細(xì)胞中MAPK代表蛋白ERK、JNK和p38的磷酸化均增加;ERK、JNK的抑制劑預(yù)處理細(xì)胞,導(dǎo)致新生隱球菌感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)CCL7降低,而p38的抑制劑處理巨噬細(xì)胞則沒有這種現(xiàn)象。本部分結(jié)果提示巨噬細(xì)胞感染新生隱球菌后可以通過MAPK中的ERK、JNK信號(hào)通路來增強(qiáng)CCL7的產(chǎn)生來增強(qiáng)免疫。第三部分:IL-17可通過MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中CCL7的表達(dá)上調(diào)本部分將探討IL-17對(duì)新生隱球菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CCL7產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞,待其呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)時(shí)分別以不同濃度的rhIL-17(25,50以及100 ng/ml)預(yù)處理巨噬細(xì)胞,并與新生隱球菌以1:10的比例共同孵育12小時(shí)。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組,對(duì)照組為未加入rhIL-17預(yù)處理但與新生隱球菌以1:10的比例共孵育的等體積巨噬細(xì)胞,也即加入rhIL-17的濃度為0 ng/ml。1.不同濃度rhIL-17(0,25,50以及100 ng/ml)預(yù)處理后,ELISA檢測(cè)巨噬細(xì)胞抗新生隱球菌免疫過程中CCL蛋白的表達(dá)水平;用100 ng/ml rhIL-17預(yù)處理后,并用western blotting分別檢測(cè)巨噬細(xì)胞與新生隱球菌共培養(yǎng)0、8、12小時(shí)后ERK、p38、JNK的表達(dá)水平。2.控制實(shí)驗(yàn)因素,即在用rhIL-17刺激之前,分別用各自信號(hào)通路的特定抑制劑處理巨噬細(xì)胞,并與新生隱球菌以1:10的比例共同孵育12小時(shí)后,ELISA檢測(cè)評(píng)估CCL7的表達(dá);另一方面,在用rhIL-17刺激巨噬細(xì)胞之前,用CCL7阻斷抗體處理,并與新生隱球菌以1:10的比例共同孵育12小時(shí)后,western blotting檢測(cè)ERK、JNK的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1.巨噬細(xì)胞在不同濃度的IL-17(對(duì)照組0ng/ml,實(shí)驗(yàn)組25、50和100ng/ml)中培養(yǎng)12h,CCL7的表達(dá)在基因和蛋白層面都隨著IL-17的濃度的升高而依次遞增,在100 ng/ml時(shí)最高;而western blotting結(jié)果示:用100 ng/ml rhIL-17預(yù)處理后,巨噬細(xì)胞與新生隱球菌共培養(yǎng)后ERK、p38、JNK的磷酸化水平升高。2.ERK的抑制劑MEK(U0126,10μm)、JNK的抑制劑JNK(SP600125,10μm)預(yù)處理細(xì)胞,導(dǎo)致IL-17介導(dǎo)CCL7表達(dá)較對(duì)照組明顯降低,p38的抑制劑p38(SB203580,10μM)卻未產(chǎn)生明顯影響。而在用rhIL-17刺激之前,用CCL7阻斷抗體處理,然后以100 ng/ml rhIL-17預(yù)處理巨噬細(xì)胞,并與新生隱球菌以1:10的比例共同孵育12小時(shí)后,western blotting檢測(cè)ERK、JNK的表達(dá)水平,結(jié)果示,ERK、JNK表達(dá)無明顯改變。本部分結(jié)果提示:IL-17可以通過上調(diào)MAPK信號(hào)通路表達(dá)調(diào)節(jié)新生隱球菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CCL7的產(chǎn)生。
【圖文】：

圖 1.1 患者及健康對(duì)照者外周血 PBMC 中 IL-17 表達(dá)情況（* 表示患者組與健康對(duì)照組比較，P<0.05）隱球菌菌株 H99 刺激小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW264.7 后 IL-17mRN活新生隱球菌 H99 與生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的巨噬細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)，8、12 小時(shí)后收集細(xì)胞提取 RNA，利用特異性 IL-17 引物對(duì)其進(jìn)表達(dá)。R-T PCR 結(jié)果表明，，熱滅活新生隱球菌與巨噬細(xì)胞共培達(dá)成時(shí)間依賴性增高，在 12 小時(shí)達(dá)到最高。但在孵育第 4 小統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，8小時(shí)和12小時(shí)表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P分別為0.0

P<0.05）2.新生隱球菌菌株 H99 刺激小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW264.7 后 IL-17mRNA 的表達(dá)（圖1.2）。熱滅活新生隱球菌 H99 與生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的巨噬細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)，分別在共培養(yǎng)的 0、4、8、12 小時(shí)后收集細(xì)胞提取 RNA，利用特異性 IL-17 引物對(duì)其進(jìn)行 RT-PCR檢測(cè) IL-17 表達(dá)。R-T PCR 結(jié)果表明，熱滅活新生隱球菌與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，IL-17的 mRNA 表達(dá)成時(shí)間依賴性增高，在 12 小時(shí)達(dá)到最高。但在孵育第 4 小時(shí)表達(dá)與 0小時(shí)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，8小時(shí)和12小時(shí)表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P分別為0.018和0.003。圖 1.2 新生隱球菌菌株 H99 與 RAW264.7 共培養(yǎng)不同時(shí)長(zhǎng)后 IL-17mRNA 表達(dá)(*表示與共培養(yǎng) 0 小時(shí)比較，P<0.05
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R519.4

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本文編號(hào)：2599592