本文關(guān)鍵詞：Ⅰ-Ⅳ型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1通用型單克隆抗體的制備及NS1抗原檢測ELISA方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：登革病毒(dengue virus, DV或DENV)可以感染人類并導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床疾病,引起的登革出血熱和登革休克綜合征病死率高。因些對登革病毒感染患者的早期診斷有很重要的意義。登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1具有較強的免疫原性,早期即可出現(xiàn)在感染了登革病毒的患者血清中,且出現(xiàn)時間早于IgM抗體,有研究表明其可以用于登革熱的早期診斷以及病情監(jiān)測。因此,NS1有望成為早期診斷登革病毒感染的方法。本課題研究利用生物信息軟件分析四種血清型登革病毒NS1的抗原表位,選擇四種血清型NS1蛋白中共同保守的抗原表位通過與小分子載體BSA偶聯(lián),通過免疫小鼠以及雜交瘤技術(shù)制備獲得四個型別NS1通用型單克隆抗體23株。同時根據(jù)Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1蛋白基因序列設(shè)計特異性NS1引物,經(jīng)RT-PCR得到四種型別的NS1全基因,并分別克隆到pMD19T載體上,隨后,經(jīng)BamH Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切將目的片段進一步克隆到表達(dá)載體pET30a上,構(gòu)建Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1蛋白BL-21高效表達(dá)菌株。表達(dá)菌株經(jīng)培養(yǎng)和IPTG誘導(dǎo),目的蛋白獲得高效表達(dá),四型表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western Blot鑒定后,進一步經(jīng)過透析復(fù)性和蛋白純化,制備獲得重組I-IV型登革病毒NS1蛋白,濃度達(dá)2.7mg/ml。隨后,利用制備獲得的I-IV型登革病毒NS1通用單克隆抗體和重組的NS1蛋白建立ELISA檢測體系,通過雙抗夾心法成功建立了基于登革病毒NS1抗原的ELISA檢測方法。
【關(guān)鍵詞】：登革病毒 非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 單克隆抗體 重組蛋白 ELISA
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.8
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-9
• 前言9-14
• 第一部分 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1通用單克隆抗體的制備14-26
• 1 實驗材料14-16
• 1.1 免疫抗原和檢測抗原14
• 1.2 主要試劑14-15
• 1.3 實驗動物15
• 1.4 主要實驗材料15
• 1.5 主要實驗儀器15-16
• 1.6 主要溶液配方16
• 2 實驗操作與方法16-22
• 2.1 免疫抗原的選擇和制備16-17
• 2.2 免疫動物17
• 2.3 小鼠免疫后經(jīng)ELISA方法檢測其血清效價17-18
• 2.4 制備飼養(yǎng)細(xì)胞18
• 2.5 雜交瘤細(xì)胞的制備18-19
• 2.6 單克隆細(xì)胞株的篩選19
• 2.7 腹水的制備19
• 2.8 腹水抗體的純化19-20
• 2.9 抗體蛋白濃度的檢測20-21
• 2.10 間接免疫熒光檢測抗體特異性21
• 2.11 Western blots檢測抗體特異性21-22
• 2.12 單克隆抗體穩(wěn)定性的檢測22
• 3 結(jié)果與分析22-24
• 3.1 免疫小鼠以及血清效價檢測22
• 3.2 雜交瘤細(xì)胞的制備和篩選22-23
• 3.3 抗體的純化23
• 3.4 免疫熒光法檢測抗體23
• 3.5 Western blots檢測抗體23-24
• 3.6 雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性研究24
• 4 討論24-26
• 第二部分 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1基因克隆、表達(dá)、純化及鑒定26-44
• 1 實驗材料26-28
• 1.1 病毒與細(xì)胞26
• 1.2 菌株26
• 1.3 載體質(zhì)粒26
• 1.4 酶、抗體以及試劑盒26-27
• 1.5 主要的生物化學(xué)試劑27
• 1.6 主要實驗儀器27
• 1.7 主要溶液配方27-28
• 2 實驗操作與方法28-38
• 2.1 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒的獲取28
• 2.2 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒核酸的提取28
• 2.3 病毒cDNA的獲取28-29
• 2.4 Ⅰ-Ⅳ登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1全基因的獲取29-30
• 2.5 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1-pMD19T載體的構(gòu)建30-32
• 2.6 pET30a-NS1表達(dá)載體的構(gòu)建32-34
• 2.7 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化34-35
• 2.8 Ⅰ-Ⅳ登革病毒NS1重組蛋白的表達(dá)及純化35-36
• 2.9 SDS-PAGE檢測36-37
• 2.10 Western blots鑒定重組蛋白37
• 2.11 Ⅰ-Ⅳ登革病毒重組蛋白NS1免疫原性的檢測37-38
• 3 結(jié)果與分析38-42
• 3.1 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1全基因的獲取38
• 3.2 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1-pMD19T載體的構(gòu)建及鑒定38-39
• 3.3 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒pET30a-NS1表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定39-40
• 3.4 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化40
• 3.5 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1重組蛋白的純化及鑒定40-41
• 3.6 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1重組蛋白免疫原性的檢測41-42
• 4 討論42-44
• 第三部分 登革病毒NS1抗原ELISA檢測方法的建立44-51
• 1 實驗材料44
• 1.1 實驗試劑和材料44
• 1.2 主要實驗器材44
• 2 實驗操作與方法44-46
• 2.1 捕獲抗體和檢測抗體的選擇44-45
• 2.2 確定最佳包板濃度、生物素檢測抗體濃度以及親和素抗體濃度45
• 2.3 雙抗夾心檢測方法的建立45
• 2.4 變異系數(shù)以及穩(wěn)定性的初步檢測45-46
• 2.5 最低抗原檢出下限的測定46
• 2.6 特異性檢測46
• 2.7 臨床血清學(xué)檢測46
• 3 結(jié)果分析46-50
• 3.1 捕獲抗體和檢測抗體的選擇46
• 3.2 確定最佳包板濃度和生物素檢測抗體濃度以及親和素抗體濃度46-48
• 3.3 雙抗體夾心檢測方法的建立48
• 3.4 變異系數(shù)以及穩(wěn)定性的初步檢測48-49
• 3.5 最低抗原檢測下限49-50
• 3.6 ELISA檢測方法的特異性50
• 3.7 臨床血清學(xué)檢測50
• 4 討論50-51
• 小結(jié)51-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 附錄57-58
• 致謝58-59
• 個人簡歷59-60

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳培標(biāo);劉少群;楊少逵;王小英;許奕濤;;潮州市2008年登革熱流行病學(xué)分析及防制對策[J];華南預(yù)防醫(yī)學(xué);2009年06期

  本文關(guān)鍵詞：Ⅰ-Ⅳ型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1通用型單克隆抗體的制備及NS1抗原檢測ELISA方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：258635