【摘要】：目的侵襲性曲霉菌感染(invasive aspergillosis,IA)嚴(yán)重的威脅著免疫力低下病人的生命,早期準(zhǔn)確的診斷與治療是良好預(yù)后的關(guān)鍵。本研究擬建立核酸序列依賴擴增聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(NASBA-ELISA)檢測曲霉菌的方法,并結(jié)合GM試驗和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)輔助診斷侵襲性曲霉病,為其提供的最佳實驗室診斷策略。方法將NASBA方法和高靈敏度的地高辛檢測系統(tǒng)相結(jié)合,以鏈酶親和素包被的微孔板為反應(yīng)平臺,采用地高辛標(biāo)記NASBA恒溫擴增曲霉菌特異性18sRNA基因片段;并用生物素標(biāo)記的DNA探針雜交捕獲地高辛標(biāo)記的NASBA擴增產(chǎn)物,然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體和底物進行酶標(biāo)顯色,并對其靈敏度、特異度進行評價。最后進行臨床驗證:收集86例IA高�；颊叩难鍢�(biāo)本,分別用NASBA-ELISA、RT-PCR和GM試驗對其進行檢測,比較這3種方法的性能指標(biāo),并對各種可能的聯(lián)合診斷方案進行比較分析,擬找到一種最佳的IA實驗室診斷方案。結(jié)果成功建立NASBA-ELISA檢測曲霉菌的方法,其靈敏度可達1 Cfu,特異性良好;ELISA的光密度值(OD)與霉菌孢子量的對數(shù)存在線性相關(guān)關(guān)系(y=0.278x+0.119,R2=0.887)。NASBA-ELISA、GM及RT-PCR試驗方法的靈敏度分別為80.56%、58.33%、72.22%,特異度分別為80.00%、82.00%、84.00%。在聯(lián)合診斷時,NASBA-ELISA與RT-PCR串聯(lián)方案具有最完美的特異度(100%)和陽性預(yù)測值(100%);NASBA-ELISA和RT-PCR并聯(lián)方案則有最好的靈敏度(94.12%)與尤登指數(shù)(0.652)。結(jié)論NASBA-ELISA方法可半定量檢測曲霉菌,具有敏感性高、特異性強、操作簡便的特點,適合常規(guī)實驗室開展,為侵襲性曲霉病的早期診斷提供了一條新方法。同時與其他檢測方法進行聯(lián)合的診斷方案能夠顯著優(yōu)化診斷效能,進一步提高臨床早期診斷侵襲性曲霉病的準(zhǔn)確性。
【圖文】：

圖 1.1 電泳檢測 NASBA 擴增產(chǎn)物的靈敏度Fig 1.1 Analytical sensitivity of NASBA followed by 1% agarose gelelectrophoresis with Goldview for 10-fold serial dilutions of genomicRNA extracted from a saline solution containing 105 CFU注：M 為 Marker；1-7 分別為 NASBA 檢測 105CFU、104CFU、103CFU、102C1 CFU、0.1 CFU；8 為陰性對照。3.2 NASBA 結(jié)合 ELISA 檢測曲霉菌靈敏度評價NASBA 擴增梯度稀釋的曲霉孢子提取的 RNA，經(jīng) ELISA 方法檢圖 1.2，表明本方法靈敏度可達 1 個孢子，且 OD 值與曲霉菌孢子量的性相關(guān)關(guān)系見圖 1.3；NASBA 擴增曲霉菌后連續(xù)等倍稀釋，再經(jīng) ELIS果見圖 1.4，可見吸光度值與所測 RNA 的濃度變化成正相關(guān)。

圖 1.2 NASBA-ELISA 方法檢測曲霉菌的靈敏度評價 Sensitivity of the NASBA-ELISA for molecular detection of Aspergillus 180.0870.1320.3020.4330.6751.3461.7450.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0OD:405nmspores concentration10-1100101102103
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R519

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本文編號：2526903