【摘要】：我國(guó)人群乙型肝炎病毒(HBV)的攜帶率為7.18%,給血液安全工作帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。限于檢測(cè)方法的技術(shù)局限性,血液篩查常用的酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)技術(shù)存在一定程度的漏檢,尤其是對(duì)處于感染“窗口期”、變異病毒株感染,免疫靜默感染或隱匿性感染等情況下的樣本。HBV的隱匿性感染(OBI)狀態(tài),是排除感染窗口期的情況下,由于某種原因?qū)е赂腥菊唧w內(nèi)HBsAg表達(dá)減少或者突變而表現(xiàn)為HBsAg"DNA+。對(duì)于OBI,現(xiàn)有的HBsAg篩查顯然無(wú)能為力,為此核酸檢鋇(NAT)被廣泛應(yīng)用于血液篩查。但是近年來(lái)的研究表明,即使使用NAT血液篩查,對(duì)于OBI的病例仍存在一定的漏檢風(fēng)險(xiǎn)。為進(jìn)一步保障血液安全,亞甲藍(lán)光化學(xué)法(MB-P)已廣泛應(yīng)用于血漿病毒滅活,其原理是在光能量作用下,亞甲藍(lán)分子受到激發(fā),破壞血液成分中病原體結(jié)構(gòu),使其不再具有感染活力。已知MB-P滅活作用的靶位點(diǎn)主要是病毒的核酸和包膜,對(duì)血液中的脂質(zhì)包膜病毒和某些非脂質(zhì)包膜病毒都有一定的滅活作用,但是其滅活機(jī)理,尤其是滅活作用對(duì)HBV分子結(jié)構(gòu)的影響還有待進(jìn)一步闡明。本文將從血液安全出發(fā)對(duì)OBI形成和MB-P對(duì)HBV的作用機(jī)理兩方面進(jìn)行初步探討。 第一部分,了解OBI在上海地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血人群中的流行狀況,并分析HBV DNA載量、HBV血清標(biāo)記物的狀態(tài)、HBV基因型和S區(qū)氨基酸的突變情況與OBI的關(guān)系,以推測(cè)OBI形成的可能原因,為改進(jìn)HBV的篩查方法和減少HBsAg的漏檢提供依據(jù)。研究中,收集了上海市血液中心2011年10月至2012年7月期間無(wú)償獻(xiàn)血者初篩合格血液樣本,使用核酸檢測(cè)進(jìn)行定性和定量分析,對(duì)HBsAg-DNA+的樣本進(jìn)行HBV五項(xiàng)血清標(biāo)記物的檢測(cè),然后抽提DNA,應(yīng)用巢式PCR法進(jìn)行S區(qū)擴(kuò)增、克隆測(cè)序、基因分型和突變分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)250360例無(wú)償獻(xiàn)血樣本中有197例HBsAg-DNA+這些樣本的HBV DNA定量范圍為0～7.11×1031U/ml,其中48.78%的樣本DNA載量低于100IU/ml。對(duì)197例樣本進(jìn)行HBV血清學(xué)乙肝五項(xiàng)檢測(cè),其中25例(25/197,12.7%)血清學(xué)標(biāo)記物全部為陰性,推測(cè)可能為HBV窗口期或者原發(fā)性O(shè)BI,需隨訪定論。172例(172/197,87.3%)為HBcAb+或HBsAb+樣本,確認(rèn)為OBI。因此得出上海地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血人群中OBI的流行率為0.069%(172/250360),低于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)。對(duì)47/172例OBI樣本進(jìn)行S區(qū)突變分析,17例經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增出S區(qū),擴(kuò)增效率為36.17%(17/47),其中14例為C亞型,突變率為35.71%(5/14)；3例為B亞型,突變率為33.33%(1/3)。可見(jiàn)OBI病例中HBV C亞型顯著高于B亞型,這與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致。發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)的突變位點(diǎn)126aa和130aa,可能與OBI的形成有關(guān)。OBI樣本中HBV DNA的低載量對(duì)NAT血液篩查的靈敏度提出了更高的要求,提示即使開(kāi)展NAT血液篩查,仍可能有部分OBI樣本漏檢。 第二部分,研究了MB-P滅活后HBV對(duì)小鼠的免疫作用,以期進(jìn)一步探討MB-P滅活機(jī)理,為該方法在進(jìn)一步降低感染性輸血風(fēng)險(xiǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。鑒于MB-P對(duì)病毒核酸的作用機(jī)理已經(jīng)闡明,且MB-P病毒滅活效果已經(jīng)實(shí)驗(yàn)室、動(dòng)物模型以及臨床驗(yàn)證,本研究擬對(duì)報(bào)道較少的MB-P對(duì)HBV包膜抗原性的影響進(jìn)行初步探討。選擇有HBV復(fù)制的HepG2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)上清,經(jīng)蔗糖梯度離心法和超濾管離心法濃縮純化上清液中的HBV,并以HepG2細(xì)胞上清作為對(duì)照,經(jīng)MB-P滅活后,ELISA法檢測(cè)HBsAg和HBeAg,初步發(fā)現(xiàn)其抗原性仍然存在。使用滅活后的HBV刺激PBMC,3d后發(fā)現(xiàn)IFN-y分泌量顯著增加。之后使用動(dòng)物模型從體液和細(xì)胞免疫兩方面,探討滅活HBV對(duì)小鼠的免疫作用。使用滅活后的HBV每?jī)芍芙?jīng)皮下和腹腔多點(diǎn)免疫注射小鼠,共免疫四次。初次免疫后,每次免疫前和末次免疫后20天小鼠眼眶后靜脈叢采血,共采血4次,收集血清,ELISA測(cè)定HBsAb量,發(fā)現(xiàn)抗體隨時(shí)間而增加,在第四周時(shí)抗體普遍大于10mlU/ml,因此確定其能夠引起小鼠的體液免疫反應(yīng)。隨后從Th1/Th2平衡、特異性T細(xì)胞增殖和殺傷能力三方面探討其激起細(xì)胞免疫的作用。在末次免疫20d后,摘除眼球取血,流式細(xì)胞儀檢測(cè)到小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子(IL-2,IL-4,IL-5,IFN-γ,TNF)顯著增加。同時(shí)無(wú)菌取脾臟,CTL細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)顯示小鼠HBsAg特異性細(xì)胞殺傷能力顯著高于對(duì)照組,但MTT法未發(fā)現(xiàn)有明顯的增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雖然MB-P法能破壞HBV核酸,使HBV失去感染活性,但該方法對(duì)HBV的免疫原性沒(méi)有影響,相反,注射經(jīng)滅活后的HBV能提高小鼠的體液和細(xì)胞免疫,這一發(fā)現(xiàn)有助于更進(jìn)一步地了解MB-P的作用機(jī)理。
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【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2450547